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Konfokales Laserscanning-Mikroskop für biologische Fragestellungen

Fachliche Zuordnung Verfahrenstechnik, Technische Chemie
Förderung Förderung in 2011
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 213559419
 
Erstellungsjahr 2015

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Im Rahmen des SFB 926 Teilprojektes C03 werden grundlegende Informationen über die Wechselwirkung verschiedener Modell-Mikroorganismen mit unterschiedlich strukturierten Metalloberflächen (Mikronuen) gewonnen. Ziel ist es, das Wachstum von Biofilmen zu fördern, um diese für kontinuierliche Prozesse nutzbar zu machen. In der ersten Förderperiode, standen in diesem Rahmen zum einen die Abhängigkeiten des mikrobiellen Wachstums von der Oberflächentopographie und zum anderen der Zusammenhang von Oberflächentopographie sowie mikrobieller Produktbildung im Fokus. Bei der Untersuchung von Biofilmen kann in der Regel jedoch nicht auf standardisierte Analyseverfahren aus der Fermentationstechnik zurückgegriffen werden. Vielmehr bieten sich bildgebende Verfahren an, um beispielweise Biomassen oder Schichtdicken zu ermitteln. Das angeschaffte konfokale Laser Scanning Mikroskop (CLSM) ermöglicht die Vermessung von bis zu 150 µm dicken Biofilmen. Die Schichtdicken werden dabei anhand von Intensitätsverläufen durch das Präparat ermittelt. Zu 3D Aufnahmen der Biofilme zusammengesetzte Bilderstapel aus optischen Schnitten geben zudem Auskunft über den strukturellen Aufbau der Kulturen. Trotz intransparenter Probenoberflächen war mittels innovativer Durchflusszellen und ausgewählter Objektive auch eine online Vermessung der Biofilme möglich. Zusammenfassend konnte mit dieser Messtechnik gezeigt werden, dass die Erstbesiedlung von mikrostrukturierten Oberflächen durch P. fluorescens abhängig von der Strukturierung erfolgt. Die Ergebnisse weisen eindeutig auf eine biofilm-fördernde Wirkung von Mikronuten hin. Untersuchungen der einzelnen Entwicklungsstadien von Biofilmen auf mikrostrukturiertem Titan zeigten zudem priorisiertes Wachstum der Zellen an Ecken und Kanten der Strukturen sowie eine komplexe Struktur der Biofilme im Vergleich zu nicht strukturierten Substraten. So konnten gegenüber plangefrästen Oberflächen verstärkt Inhomogenitäten und Topographieausbildung beobachtet werden. Weiterhin ist für das Wachstum und die Produktivität von Biofilmen auch der Stofftransport von entscheidender Bedeutung. Dieser basiert in Biofilmen im Wesentlichen auf Diffusion. Für die experimentelle Ermittlung von Diffusionskoeffizienten in Biofilmen wird u. a. Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) eingesetzt. Grundlage von FRAP ist das irreversible Ausbleichen eines Fluorophors in einer Region of Interest (ROI) mit einem starken Laserpuls und die anschließende Messung der Fluoreszenzrückkehr in die gebleichte Region. Diese spezielle Messtechnik wird ebenfalls durch das verwendete CLSM bereitgestellt. Angewandt auf Biofilme ergaben sich in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer (24 bzw. 40 h) von P. fluorescens Biofilmen auf mikrostrukturierten Oberflächen für FITC-Dextrans (20 kDa) Diffusionskoeffizienten zwischen 10-50 μm^2 ∙ s^-1. Demgegenüber scheint die Diffusion des Tracers in Biofilmen auf plangefrästen Oberflächen nicht beeinträchtigt zu sein, da die ermittelten Werte im Bereich der freien Diffusion von Wasser lagen. Ein wichtiger Aspekt bei der Durchführung von FRAP-Experimenten zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten ist die mathematische Auswertung der Messdaten. Hierzu sind in der Literatur meist sehr vereinfachte, analytisch lösbare Modelle beschrieben. Die zur analytischen Lösbarkeit getroffenen Annahmen (z. B. die Homogenität der Probe) sind jedoch gerade in der Anwendung auf reale Biofilme nicht gültig. Zur Weiterentwicklung des Mess- und Auswertemethoden im Bezug auf Biofilme wurde daher ein weiterer Forschungsantrag bei der DFG eingereicht.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

 
 

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