Cytidin-Deaminase als Selektionsmarker im Rahmen der Gentherapie hämatologischer Erkrankungen
Final Report Abstract
Ziel des Projekts war die Entwicklung einer breit einsetzbaren, nebenwirkungsarmen, in vivo Selektionsstrategie für die hämatopoetische Gentherapie unter Einsatz der Cytidin Deaminase (CDD) als Selektionsmarker sowie die Evaluation des Einsatzes der CDD als CTX-R Gen zur Reduktion der myelosuppressiven Nebenwirkungen der Kombinationschemotherapie (Myeloprotektion). Dabei wurde zunächst, vor dem Hintergrund einer in der Vergangenheit unbefriedenden Selektion im murinen Modell mit unterschiedlichen Ara-C Applikationsschemata (kurzzeitig, hochdosiert versus protrahiert, niedrig dosiert) zur Optimierung der CDD-vermittelten Selektion die Eignung alternativer Ara-C Applikationsformen zur in vivo Selektion analysiert. Dabei wurde auf solche Schemata zurückgegriffen, bei denen nach Literaturlage eine besonders hohe Toxizität für hämatopoetische Stammzellen zu erwarten war, wie die kombinierte Gabe von Ara-C mit hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, Interferon-α, oder 5-Fluorouracil. Allerdings gestaltete sich die Identifizierung eines geeigneten HSZ-toxischen Ara-C Applikationsprotokolls trotz der Verfolgung all dieser Ansätze als problematisch. Daher wurde in der Folge die kombinierte Expression der CDD mit einem bereits etablierten selektionierbaren CTX-R Gen, dem MDR1, untersucht. Hierbei konnte, zunächst in vitro, sowohl die Protektion hämatopoetischer Zellen vor CDD- und MDR1-assoziierten Zytostatika wie auch die effiziente Selektion transduzierter Zellen nachgewiesen werden. Angesichts der Tatsache, dass die Kombination von CDD und MDR1 die aktuell in der Induktionstherapie der akuten myeloischen Leukämie (AML) wichtigsten Zytostatika Ara-c und Anthrazykline abdeckt, befindet sich eine Antragstellung bei der Deutschen Krebshilfe zur weiteren Evaluierung dieser Strategie im Rahmen der AML Therapie aktuell in Vorbereitung. Deutlich einfacher gestaltete sich die Entwicklung neuer und sicherheitsmodifizierter lentiviraler Konstrukte für die effektive CDD-Expression. Da frühere Studien eine Toxizität der transgenen CDD-Überexpression in lymphatischen Zellen zumindest nicht ausschließen konnten, haben wir hier zum einen Doxyzyklin-induzierbare Konstrukte evaluiert, welche eine nur vorübergehende CDD-Expression während der Zytostatika-Applikation erlauben. Daneben wurde ein Ansatz zur „Lymphozyten-aussparenden“ CDD-Expression unter Verwendung einer „miRNA-150 target site“ entwickelt, welche nach Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen die gezielte Abschaltung der Transgen-Expression in Lymphozyten vermittelt. Diese Studien werden mit optimierten, lentiviralen SIN (self inactivating) Vektoren durchgeführt, welche sowohl ein hohes CDD-Expressionsniveau erlauben als auch ein reduziertes Risikopotential hinsichtlich insertionaler Mutagenese besitzen. Doxyzyklininduzierbaren Vektoren wurden auch bei der Entwicklung des “knock-downs“ der deoxy-Cytidinkinase (dCK) als neues Prinzip zur Generierung einer Zytostatikaresistenz eingesetzt. Dabei überlappen die dCK-“knock-down“ assoziierten Zytostatika zum Teil mit dem Resistenzspektrum der CDD (Ara-C), schließen aber auch modernere Deaminase-resistenten Cytidinanaloga wie Fludarabin ein. Eine translational ausgerichtete Fortführung dieser Arbeiten wird aktuell bei der Deutschen Jose Carreras-Stiftung beantragt. Zusammenfassend hat dabei aus unserer Sicht die Entwicklung von Vektoren für regulierbare Transgenexpression grundlegende Bedeutung für das gesamte Feld der hämatopoetischen Gentherapie und dürfte in Zukunft die Vermeidung Transgen-spezifischer Nebenwirkungen wesentlich erleichtern. Zudem besitzen die hier beschriebenen Arbeiten eine unmittelbare Relevanz für die Erarbeitung „myeloprotektiver“ Strategien im Rahmen der Chemotherapie von Tumoren und Leukämien, wie sie aktuell bereits erfolgreich zur Optimierung der Therapie von Glioblastomen eingesetzt werden.
Publications
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(2012) Micro RNA-150 regulated vectors allows lymphocyte-sparing transgene expression in hematopoietic gene therapy. Gene Ther, 19 (9):915-24
Lachmann N, Jagielska J, Heckl D, Brennig S, Pfaff N, Maetzig T, Modlich U, Cantz T, Gentner B, Schambach A, Moritz T
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(2012). In vivo enrichment of cytidine deaminase gene-modified hematopoietic cells by prolonged cytosinearabinoside application. Cytotherapy, 14 (4):451-60
Brennig S, Rattmann I, Lachmann N, Schambach A, Williams DA, Moritz T
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(2013) Efficient in vivo regulation of cytidine deaminase expression in the hematopoietic system using a doxycycline-inducible lentiviral vector system. Gene Ther, 20 (3):298-307
Lachmann N, Brennig S, Pfaff N, Schermeier H, Dahlmann J, Phaltane R, Gruh I, Modlich U, Schambach A, Baum C, Moritz T
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(2015) “Chemoprotection of murine hematopoietic cells by combined gene transfer of cytidine deaminase (CDD) and multidrug resistance 1 gene (MDR1)”, J Exp Clin Cancer Res, 34 (1):148
Brennig S, Lachmann N, Buchegger T, Hetzel M, Schambach A, Moritz T
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(2015) „Deoxycytidine-kinase (dCK) knock-down as a novel myeloprotective strategy in the context of fludarabine, cytarabine, or cladribine therapy“, Leukemia, 29:2266-69
Lachmann N, Czarnecki K, Brennig S, Phaltane R, Heise M, Heinz N, Kempf H, Dilloo D, Kaever V, Schambach A, Heuser M, Moritz T
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(2015) „Tightly regulated 'all-in-one' lentiviral vectors for protection of human hematopoietic cells from anticancer chemotherapy”. Gene Ther, 22 (11):883-92
Lachmann N, Brennig S, Hillje R, Schermeier H, Phaltane R, Dahlmann J, Gruh I, Heinz N, Schiedlmeier B, Baum C, Moritz T
