Spinning-disk Fluoreszenz-Mikroskop mit FRAP-Zusatz
Final Report Abstract
Für Immunantworten, die Embryonalentwicklung oder die Entstehung von Metastasen ist es entscheidend, dass Zellen gerichtet wandern können. Wir haben lebende Zellen bei der Wanderung mit Hilfe des Spinning-disk Fluoreszenz-Mikroskops beobachtet. Dabei konnten wir zeigen, dass Mitglieder der Familie der Rho GTPasen sowie der aktin-abhängigen Myosin Motormoleküle eine wichtige Rolle für die Orientierung in einem Chemokin-Gradienten, sowie die Geschwindigkeit und Direktionalität der Wanderung spielen. Ihr Fehlen führt zu einem gestörten Wanderungsverhalten. Bei der Chemokin-induzierten Wanderung von Zellen könnte auch Ca2+ als Botenstoff eine wichtige Rolle spielen. Stimulation der Zellen mit einem Chemokin löst einen kurzzeitigen Anstieg der intrazellulären Ca2+ -Ionen Konzentration aus, bevor eine Veränderung der Zellform beobachtet werden konnte. Makrophagen sind spezialisierte Fresszellen, die Bakterien, Zelltrümmer und andere Partikel durch Phagozytose aufnehmen können. Aus dem Peritoneum von Mäusen isolierte Makrophagen, deren Aktinzytoskelett durch ein Fluoreszenzprotein markiert war, wurden dabei beobachtet, wie sie mit Hilfe von Veränderungen des Aktinzytoskeletts fluoreszierende Partikel aufnahmen. Dabei zeigten sich mehrere unterschiedliche Muster der Partikelaufnahme. Das Spinning-disk Fluoreszenz-Mikroskop wurde auch für Untersuchungen der Dynamik der Mitochondrien in Zellen eingesetzt. Diese Untersuchungen wurden mit menschlichen Zelllinien und primären hippocampalen Nervenzellen der Ratte durchgeführt. Dabei konnten wir zeigen, dass ein bestimmtes Motormolekül die Länge der Mitochondrien und ihre Verteilung in der Zelle beeinflussen kann. Das FRAP Modul wurde dabei zur gezielten Photoaktivierung von Fluoreszenzprotein in ausgewählten Mitochondrien genutzt. Dies erlaubte eine bessere Analyse der mitochondrialen Dynamik. Um aufzuklären, wie die intrazelluläre Lokalisation von Myosin 9b durch die Aktivität des monomeren G-Proteins Rac beeinflusst wird, haben wir photo-aktivierbares Rac verwendet. Dabei wurde photoaktivierbares Rac in zellulären Regionen von Interesse gezielt mit Hilfe der FRAP-Einheit aktiviert und der Einfluss auf die Aktinzytoskelettorganisation und die Verteilung des Myosin 9b analysiert. Dabei zeigte sich, dass Myosin 9b als Verbindungsglied zwischen den Rac und Rho-Signalwegen dienen könnte.
Publications
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