Automatisiertes Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopsystem
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Faltung neusynthetisierter Polypeptidketten in ihre native und funktionelle Konformation stellt einen komplexen und anfälligen Prozess dar. Fehler in Transkriptions- und Translationsprozessen, sowie externe und interne Streßbedingungen können zu einer erhöhten Proteinmißfaltung und nachfolgend Proteinaggregation führen. Im Fokus der Anwendungen des Fluoreszenzmikroskops stand die Verfolgung des Aggregationsprozesses in Zellen (1) sowie die Auflösung von Proteinaggregaten durch molekulare Chaperone in den Modellorganismen Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae (2). (1) Es konnte gezeigt werden, dass sich abhängig von applizierten Streßbedingungen unterschiedliche Proteinablagerungen in Zellen ausbilden. Abhängig vom Modellorganismus werden die Proteinaggreate an unterschiedlichen, jedoch spezifischen zellulären Stellen abgelagert. Diese Ablagerung erlaubt eine asymmetrische Verteilung der mißgefalteten Proteine nach Zellteilung und die Bildung von Tochterzellen ohne Proteinaggregate. Dies stellt einen zellulären Verjüngungsprozess dar. Die Ausbildung von Proteinaggregaten in Hefezellen ist durch zelluläre Faktoren kontrolliert. Wir konnten zeigen, dass Kompartiment-spezifische Aggregasen die Bildung von Proteinaggregaten im Zytosol (Hsp42) und Zellkern (Btn2) steuern. Im Kern kontrolliert Btn2 ebenfalls die Ausbildung spezifischer Proteinablagerungen unter DNA- Stress, welche evtl. regulatorische Funktion besitzen. Zur Verfolgung der Proteinablagerungen wurden fluoreszierende Modellproteine in den Modellorganismen exprimiert und deren zelluläre Lokalisation unter Verwendung des Fluoreszenzmikroskops bestimmt. Das Hitzeschockmodul erlaubte es, die Ausbildung und Auflösung von Proteinaggregaten in einzelnen Zellen zeitaufgelöst zu verfolgen. (2) Kooperierende Hsp70 und Hsp100 Chaperone reaktivieren aggregierte Proteine. Diese Aktvität ist entscheidend für das Überleben von Zellen bei extremen Stressbedingungen. Wir konnten unter Verwendung von fluoreszierenden Chaperonvarianten und dem Fluoreszenzmikroskop eine Hierarchie der Chaperonaktivitäten an Proteinaggregaten und Prionenfibrillen bestimmen. Hsp70 Bindung an Aggregate und Prionen bewirkt die Rekrutierung und Aktivierung kooperierender Hsp100 Chaperone. Dies stellt den konservierten Mechanismus der Auflösung von Proteinaggregaten dar.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Hsp70 proteins bind Hsp100 regulatory M domains to activate AAA+ disaggregase at aggregate surfaces. Nat Struct Mol Biol. 2012, 19:1347-1355
Seyffer, F., E. Kummer, Y. Oguchi, J. Winkler, M. Kumar, R. Zahn, V. Sourjik, B. Bukau, and A. Mogk
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Hsp70 targets Hsp100 chaperones to substrates for protein disaggregation and prion fragmentation. J Cell Biol. 2012, 198:387-404
Winkler, J., J. Tyedmers, B. Bukau, and A. Mogk
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ClpV recycles VipA/VipB tubules and prevents non-productive tubule formation to ensure efficient type VI protein secretion. Mol Microbiol. 2013, 87:1013-1028
Kapitein, N., Bönemann, G., Pietrosiuk, A., Seyffer, F., Hausser, I. Locker, J.K., Mogk, A.
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Coordination of translational control and protein homeostasis during severe heat stress. Curr Biol. 2013, 23:2452-2462
Cherkasov, V., S. Hofmann, S. Druffel- Augustin, A. Mogk, J. Tyedmers, G. Stoecklin, and B. Bukau
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Mechanism of Hsp104/ClpB inhibition by prion curing Guanidinium hydrochloride. FEBS Lett. 2013, 587:810-817
Kummer, E., Y. Oguchi, F. Seyffer, B. Bukau, and A. Mogk
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Compartment-specific aggregases direct distinct nuclear and cytoplasmic aggregate deposition. EMBO J. 2015, 34:778-797
Miller, S.B., C.T. Ho, J. Winkler, M. Khokhrina, A. Neuner, M.Y. Mohamed, D.L. Guilbride, K. Richter, M. Lisby, E. Schiebel, A. Mogk, and B. Bukau
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Prolonged starvation drives reversible sequestration of lipid biosynthetic enzymes and organelle reorganization in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 2015, 26:1601-1615
Suresh, H.G., A.X. da Silveira Dos Santos, W. Kukulski, J. Tyedmers, H. Riezman, B. Bukau, and A. Mogk
