Hochgeschwindigkeits-Zellsortiergerät (FACS)
Final Report Abstract
Ziel der Vorhaben, in denen das Gerät (Hochdurchsatz-FACS) vorwiegend zum Einsatz kommt, ist die Isolierung von Peptid- und Protein-basierten Biomolekülen für den Einsatz in Zellbiologie, Bioanalytik und Medizin. Dabei werden zufallsmäßig Varianten von vorgegebenen Gerüstproteinen erzeugt und in vielfacher Kopie auf der Oberfläche von Hefezellen präsentiert. Durch Zugabe eines fluoreszenzmarkierten Zielproteins werden Zellen, die ein funktionales Bindeprotein tragen, markiert und im Hochgeschwindigkeitszellsorter (FACS) aussortiert. Die molekularen Bibliotheken, die erzeugt werden, waren zum Anschaffungszeitpunkt in der Größenordnung von 2x108 Kandidaten. Mittlerweile werden Bibliotheksgrößen in Bereich von 109 Zellen generiert. Für deren Durchmusterung wurde die FACS-Screening Strategie soweit optimiert, dass ein Durchsatz von täglich bis zu 10 9 Zellen möglich ist. Das Gerät kam dabei in zwei Anwendungsfeldern zum Einsatz. Zum einen wurden kombinatorische Bibliotheken von sogenannten Cystinknoten-Miniproteinen generiert, kleinen disulfidreichen Proteinen mit ca. 30 Aminosäuren Länge, die sich durch eine hohe Stabilität und konformationelle Rigität auszeichnen. Es wurden durch FACS Varianten des Miniproteins MCoTI-II und des Miniproteins SOTI-III isoliert, die mit hoher Affinität die humane Protease Matriptase I binden und inhibieren, ein Protein, das in vielen Tumoren überproduziert wird und auch bei der Tumormetastasierung eine Rolle spielt. Weiterhin wurden Miniproteinbasierte Binder des Zielproteins CTLA-4 erhalten, das in der Immuntherapie eine Rolle spielt. Als zweites Strukturgerüst zur Isolierung von Bindemolekülen wurde das Grundgerüst der Antigenbindedomäne von Einzelkettenantikörpern aus Haien (vNAR Domäne) herangezogen. Es wurden semisynthetische Bibliotheken generiert und es wurde ein Verfahren etabliert, das ohne Tierversuche auskommt und es ermöglicht, aus kombinatorischen Bibliotheken hochaffine Binder durch FACS zu isolieren. Die Strategie wurde durch die Generierung von Antikörpern gegen eine Reihe von Zielproteinen (EpCAM, EphA2, HtrA1) validiert. Gegenwärtig wird es intensiv eingesetzt, um pH-responsive Antikörper zu erzeugen, deren Affinität gegenüber vorgegebenen Zielproteinen durch pH-Änderung im Bereich 5,5 bis 7,5 schaltbar ist. Solche Bindemoleküle sind von Relevanz für die selektive Tumortargetierung, sowie für chromatographische Anwendungen im Downstream Processing von rekombinant produzierten Proteinen. Weiterhin wird das Gerät eingesetzt für die Quantifizierung des Outputsignals synthetischer genetischer Schaltkreise im Rahmen von Projekten innerhalb des hessischen LOEWE-Schwerpunkts CompuGene, für die Vermessung des Schaltverhaltens von RNA Aptameren (Prof. B. Suess, FB Biologie der TU Darmstadt), sowie zur Analyse transgener Zellen (Prof. C. Cardoso, FB Biologie TU Darmstadt).
Publications
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Combinatorial optimization of cystine-knot peptides towards high-affinity inhibitors of human matriptase-1. PLoS One. 2013 Oct 11;8(10):e76956
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Shark Attack: high affinity binding proteins derived from shark vNAR domains by stepwise in vitro affinity maturation. J Biotechnol. 2014 Dec 10;191:236-45
Zielonka S, Weber N, Becker S, Doerner A, Christmann A, Christmann C, Uth C, Fritz J, Schäfer E, Steinmann B, Empting M, Ockelmann P, Lierz M, Kolmar H
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Cystine-knot peptides targeting cancer-relevant human cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4). J Pept Sci. 2015 Aug;21(8):651-60
Maaß F, Wüstehube-Lausch J, Dickgießer S, Valldorf B, Reinwarth M, Schmoldt HU, Daneschdar M, Avrutina O, Sahin U, Kolmar H
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The Shark Strikes Twice: Hypervariable Loop 2 of Shark IgNAR Antibody Variable Domains and Its Potential to Function as an Autonomous Paratope. Mar Biotechnol (NY). 2015 Aug;17(4):386-92
Zielonka S, Empting M, Könning D, Grzeschik J, Krah S, Becker S, Dickgießer S, Kolmar H
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Isolation of a pH-Sensitive IgNAR Variable Domain from a Yeast-Displayed, Histidine-Doped Master Library Mar Biotechnol (NY). 2016 Apr;18(2):161-7
Könning D, Zielonka S, Sellmann C, Schröter C, Grzeschik J, Becker S, Kolmar H
