Fluoreszenzbasierte Einzelmolekülstudien zur Dynamik und Mechanismen von Argonaute Proteinen und des RISC Komplexes
Biochemie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Argonaute (AGO) Proteine sind vielseitige Akteure, die in biologische Prozesse wie der Genregulation, der Virenabwehr oder dem Prozess des RNA-Silencing in verschiedenen Organismen involviert sind. Humanes Argonaute 2 (hAGO2) und das archaeelle Argonaute aus Methanocaldococcus jannaschii (MjAGO) repräsentieren katalytisch aktive AGO-Varianten, die mithilfe einer kleinen RNA oder DNA (dem sogenannten guide) eine Zielnukleinsäure erkennen und endonukleolytisch spalten. Prokaryotische und eukaryotische AGO Proteine (pAgo, eAgo) weisen eine stark konservierte Struktur auf. Ihre biologische Funktion ist jedoch sehr unterschiedlich. eAgos fungieren als Schlüsselenzyme im Prozess der sogenannten RNA Interferenz durch den schätzungsweise 60% der menschlichen Gene reguliert werden. Fehler in diesem Prozess haben verheerende Konsequenzen und sind ursächlich für Diabetes, Krebs und Herzversagen verantwortlich. Neueste Studien zeigen, dass pAgos in einen gänzlich anderen biologischen Prozess involviert sind – der Verteidigung einer Zelle gegen fremde genetische Elemente. pAgos können in diesem Zusammenhang entweder in An- oder Abwesenheit eines guides agieren wobei in den meisten Fällen DNA statt RNA targetiert wird. Wie dies auf molekularer Ebene abläuft und reguliert wird, war jedoch nur wenig verstanden. Mit einer Reihe von biochemischen und biophysikalischen Experimenten haben wir eine neue Interaktionsmodalität für MjAgo aufgedeckt, die wir als guide slipping bezeichnen und es dieser prokaryotischen AGO-Variante ermöglicht, auch nicht-optimale DNA-Substrate flexibel zu laden. Biologisch gesehen könnte diese flexible Beladung von DNA-Substraten von Bedeutung sein, wenn doppelsträngige DNA-Substrate wie Plasmide ohne eine Beladung von AGO mit einem Guide prozessiert werden. Umfangreiche genetische Experimente zeigten zudem, dass MjAgo ein essenzielles Gen ist und nicht in M. jannaschii ausgeschaltet werden kann. Unsere Erkenntnisse können dabei helfen, MjAgo und pAgos im allgemeinen als gene editing Werkzeug und Nukleinsäure-Sensoren zu verbessern. Mit Hilfe von zeitaufgelösten Einzelmolekül-FRET-Messungen konnten wir die Konformationszustände und die Dynamik von hAgo2- und hAgo2-RNA-Komplexen in Lösung verfolgen. Wir beobachteten eine dynamische Verankerung und Freisetzung des 3‘-Endes der guide- RNA von der PAZ-Domäne während des schrittweisen Ladevorgangs des targets und entdeckten eine bisher unbekannte Konformation von hAgo2-RNA-Komplexen, die sie für den zielgerichteten miRNA-Abbau prädestiniert. Wir zeigen außerdem, dass Dicer hAgo2 öffnet, um das Laden des miRNA Duplex in AGO zu ermöglichen, und dass die ungeordneten Proteinschleifen von Dicer die Interaktionsstelle für hAgo2 bilden. Die Untersuchung der Interaktion des RNA-bindenden Proteins Mex3a, das bei Krebserkrankungen eine Rolle spielt, mit der miRNA-126-5p und hAgo2 zeigte die Konformationsänderungen auf, die zur Bildung dieses Komplexes erforderlich sind, und klärte zudem die gesamte strukturelle Organisation dieses Komplexes auf. Die Erkenntnisse, die wir bei unserer Arbeit mit menschlichem Argonaute 2, Dicer und Mex3a gewonnen haben, unterstützen entscheidend die Weiterentwicklung von RNAi-basierten Anwendungen und RNA-basierten Therapien.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Die erstaunliche Vielseitigkeit der Argonauten-Crew. BIOspektrum, 26(6), 603-605.
Willkomm, Sarah; Moissl, Benedikt; Michel, Henri & Grohmann, Dina
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Single-molecule FRET uncovers hidden conformations and dynamics of human Argonaute 2. Nature Communications, 13(1).
Willkomm, Sarah; Jakob, Leonhard; Kramm, Kevin; Graus, Veronika; Neumeier, Julia; Meister, Gunter & Grohmann, Dina
