Funktionelle Bedeutung der tandemartigen Anordnung der SNARE-Motive in SNAP-25 im Kontext der schnellen, Ca2+-abhängigen Exozytose
Final Report Abstract
Die Ausbildung membranüberbrückender Komplexe aus sogenannten soluble N-ethylmaleimidesensitive-factor attachment receptor (SNARE)-Proteinen stellt nach gegenwärtigem Kenntnisstand den entscheidende mechanistischen Schritt dar, über den die Membranfusion während der Exozytose induziert wird. Die exakte Sequenz molekularer Ereignisse, die der Fusion von Vesikeln mit der Plasmamembran zugrundeliegt, ist allerdings noch weitgehend unverstanden. Insbesondere ist bis jetzt unbeantwortet geblieben, warum sekretorische Zellen bei der Ca2+ -abhängigen Exozytose, aber nicht bei intrazellulären Membranfusionsvorgängen, strukturellspezialisierte Qbc-SNARE-Proteine einsetzen. Im Gegensatz zu regulären SNARE-Proteinen, die Typ II-Transmembranproteine darstellen und nur ein einziges SNARE-Motiv beinhalten, besitzen exozytotische Qbc-SNARE-Proteine zwei SNARE-Motive, die über eine acylierte „Linker“-Domäne in einer tandemartigen Konfiguration verknüpft sind. Im vorliegenden Projekt haben wir die funktionellen Auswirkungen dieser strukturellen Spezialisierung ergründet, und die mechanistische Rolle der „Linker“-Domäne in der Qbc-SNARE-Isoform SNAP-25 im Detail untersucht. Unsere systematische Mutationsanalyse konnte dabei ältere Vermutungen hinsichtlich einer weitgehenden Funktionslosigkeit des „Linker“ entkräften und nun eindeutig nachweisen, daß Motive innerhalb der „Linker“-Domäne einen förderlichen Einfluss auf beinahe alle mechanistischen Schrittes des Fusionsprozesses ausüben. Unsere funktionelle Charakterisierung verschiedener Substitutionsmutanten in kultivierten Chromaffinzellen zeigte dabei, dass „Linkers“-Motive das sogenannte „Priming“ der Vesikel fördern, den fusionkompetenten Zustand der Vesikel stabilisieren, die Ca2+ -abhängige Auslösung des Fusionsprozesses erleichtern und schliesslich den Austritt von Transmittern aus sekretorischen Vesikeln beschleunigen. Auf der mechanistischen Ebene, konnten wir mittels biochemischer Experimente demonstrieren, dass der „Linker“ die Ausbildung von binären Akzeptorkomplexen auf der Plasmamembran fördert und gleichzeitig den Aufbau von ternären SNARE-Komplexen beschleunigt. Besonders das C-terminale Drittel des „Linker“ ist initial wichtig für Interaktionen mit Syntaxin-1A auf der Plasmamembran und dient nachfolgend vermutlich als strukturelles Element, das den „Linker“ am Kernkomplex fixiert. Die acylierte N-terminale Region des „Linkers“ unterstützt den Fusionsvorgang in späten mechanistischen Phasen, indem sie am prospektiven Fusionsort eine SNARE:Membran- Schnittstelle etabliert. Dabei dienen acylierte Cysteinreste im N-terminalen Anteil des „Linkers“ nicht nur der Membranlokalisation, sondern unterstützen zusammen mit flankierenden Linkeranteilen auch die „Triggering“-Reaktion und die Expansion der entstehenden Fusionspore. Interessanterweise konnten wird belegen, dass der Lipidanker des „Linkers“ dabei nicht zur Kraftübertragung und zur mechanischen Deformation der Plasmamembran genutzt wird. Vielmehr beruht der fusionsfördernde Effekt wahrscheinlich darauf, dass lokale Interaktionen an der SNARE:Membran-Schnittstelle die Ordnung/Packung der Lipide sowie die Kurvatur der Membran beeinflussen und so die Reorganisation der beiden Lipiddoppelschichten bei der Bildung und Expansion der Fusionspore erleichtern. Insgesamt scheinen die vielfältigen födernden Wirkmechanismen des „Linkers“ dazu beizutragen, die Funktionalität des Fusionskomplexes zu steigern, so daß der molekulare Exozytoseapparat die erforderliche Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit für Hormonsekretion und synaptische Transmission erreichen kann.
Publications
- Complexins: small but capable. Cellular and Molecular Life Sciences, Vol. 72. 2015, Issue 22, pp. 4221–4235.
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Dhara, M., Yarzagaray, A., Makke, M., Schindeldecker, B., Schwarz, Y., Shaaban, A., Sharma, S., Böckmann, R.A., Lindau, M., Mohrmann, R. & Bruns, D.
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A. Shaaban, M. Dhara, W. Frisch, A. Harb, A. Shaib, U. Bechere r, D. Bruns & R. Mohrmann
(See online at https://doi.org/10.7554/eLife.41720)
