Entwicklung eines Nukleinsäure-basierten modularen Systems zur kontrollierten sequentiellen Freisetzung osteogener Wachstumsfaktoren auf Titanoberflächen
Final Report Abstract
Bei der Untersuchung der Hybridisierungskinetik und Hybridstabilität musste leider festgestellt werden, dass das bewährte Verfahren unter Nutzung der Fluoreszenzlöschung während der Hybridisierung beim konkret untersuchten System nicht funktionierte. Die Ursachen liegen vermutlich in unspezifischer Fluoreszenzlöschung durch die Überhänge des Ankerstranges begründet. Aus diesem Grunde wurde ein alternatives System entwickelt, das die Bindung des Fluorophores SYBR Green I in die kleine Furche des Doppelstranges nutzt. Mit diesem Alternativverfahren können bekannte Phänomene wie die Beschleunigung der Hybridisierung durch höhere Temperaturen und höhere Salzkonzentrationen, besonders durch zweiwertige Metallionen wie Mg2+, reproduziert werden. Die bisherige Betrachtung der Anfangsgeschwindigkeiten über die Annäherung als ‚Reaktion‘ pseudo-erster Ordnung muss für die zukünftige Anwendung noch durch die numerisch-iterative Ermittlung der Geschwindigkeitskonstanten ersetzt werden. Die Alternativmethode versagt dann, wenn die Hybridstabilität durch zu eng beieinander liegende Fehlpaarungen variiert werden soll. Dies führt nicht zu einer ausreichenden Ausbildung der kleinen Furche im Doppelstrang und damit nicht zur Bindung von SYBR Green I. Für die Untersuchungen der Effekte der Konjugate auf zellulärer Ebene durch die Projektpartner war die vorrangige Aufgabe, die Konjugate zu reinigen und zu charakterisieren, um über definierte Produkte eine Vergleichbarkeit verschiedener Versuchsreihen zu ermöglichen. Diese Aufgabe erwies sich als deutlich komplexer und aufwändiger als bei der Beantragung des Projektes angenommen. Bei der Reinigung zeigte sich, dass es neben den gewünschten methodenspezifischen Wechselwirkungen zwischen Molekülen und Chromatographie-Matrix (Porendiffusion bei SEC, Elektrostatik bei IEC) auch zu unspezifischen Wechselwirkungen kommt, die die Trennung negativ beeinflussen und u.U. eine Kombination von Trennverfahren nötig machen. Während beim BMP-2-Konjugat die Abtrennung des Konjugates über SEC gelang, konnte dies beim VEGF-Konjugat weder über SEC noch über IEC erreicht werden. Chromatographieverfahren stellen auch für zukünftige Reinigungen von Konjugaten das Mittel der Wahl dar, da sie die für die Wachstumsfaktoren schonendsten Methoden sind. Unabhängig von der Art der Chromatographie (IEC, SEC oder evtl. auch präparative HPLC) sind jedoch viele Optimierungsschritte notwendig, die von der Auswahl des Säulenmaterials über die Wahl des Laufmittels bis hin zu unterschiedlichen Elutionsgradienten reichen. Diese Vielzahl an Möglichkeiten erfordert viele zeitliche und finanzielle Ressourcen. Wie an den Unterschieden zwischen BMP-2- und VEGF-Konjugat ersichtlich kann auch ein etabliertes Reinigungsverfahren nicht ohne größere Anpassungen auf verschiedene Substanzen übertragen werden. Erschwerend kommt hinzu, dass die o.g. Analyseverfahren bei den vorhandenen Stoffmengen bereits an oder unter der Nachweisgrenze sind und auch unterschiedliches Verhalten in Bezug auf die Konjugate haben (vgl. MALDI-TOF bei BMP-2 vs. VEGF). Dies erfordert dann noch größere Ansätze und Referenzproben, was mit einer deutlichen Kostensteigerung für die Wachstumsfaktoren verbunden ist. Für eine erfolgreiche Umsetzung des Konzepts sollten für zukünftige Forschungsprojekte eine organisatorische und eine versuchstechnische Anpassung erfolgen. Die Modularisierung und Ökonomisierung der Konjugatsynthese sollte über größere Ansätze erfolgen, die zu ausreichend Substanz für die Analytik führen. Bei vorausgesetzter und noch zu prüfender Lagerfähigkeit über längere Zeiträume könnte die Modularisierung der Konjugation über den Einsatz von ‚Click-Chemie‘ (z.B. über Huisgen- 1,3-Zykloadditionen) oder den Einsatz von biotinylierten Wachstumsfaktoren und mit Streptavidin modifizierten ODN erfolgen.
