Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
AG Knauer/AG Schmuck/AG Epple, Projekt 1: Chemische Transporter: Die Wirksamkeit gentherapeutischer wie RNAi-basierter Ansätze hängt maßgeblich von der effizienten Einbringung der entsprechenden Nukleinsäuren in unterschiedliche Zelltypen ab. Daher entwickeln wir in enger Zusammenarbeit mit der Organischen Chemie/AG Schmuck kleine Liganden, ausgestattet mit Dipeptid-Armen mit sogenannten Guanidiniocarbonylpyrrol-Motiven als Nukleinsäure-Transporter. Eine erste Generation dieser Transporter konnte bereits durch rationale Modifikation der Molekülstruktur sowie die Optimierung des zellulären Aufnahmemechanismus verbessert werden. Momentan nutzen wir das HCS-A-Screening Modul des Konfokal-Mikroskops zur effizienten Analyse kleiner fokussierter Substanzbibliotheken peptidischer Liganden sowie von Derivaten bestehender Transporter. In Zusammenarbeit mit der Anorganischen Chemie/AG Epple konnten wir mittels Nanoformulierungen mit Calciumphosphat die Einkapselungs-Effizienz hydrophiler Substanzen wie Proteine und Nukleinsäuren und damit deren intrazelluläre Aufnahme maßgeblich steigern. AG Knauer, Projekt 2: Nanopartikel-Corona: Hinsichtlich einer späteren medizinischen Anwendung von Nanopartikeln ist es essentiell, die molekularen Ereignisse an der sogenannten Nano-Bio- Schnittstelle besser zu verstehen. Nanopartikel binden aufgrund ihrer Größe in besonderen Maße Proteine aus biologischen Flüssigkeiten, mit welchen sie in Kontakt kommen. Die sich so bildende Proteincorona ist in der Tat eine wichtige Determinante für den Erfolg biomedizinischer Anwendungen wie Tumor Targeting aber auch molekulare Bildgebung. Wir konnten kürzlich die erste zeitlich aufgelöste, standardisierte Analyse der Protein-Corona mit der intrazellulären Aufnahme der entsprechenden Partikel verknüpfen. AG Knauer/AG Kaiser, Projekt 4: Taspase1: Die Protease Taspase1 spaltet onkologisch relevante zelluläre Substrate wie das MLL-Protein sowie unterschiedliche Transkriptionsfaktoren und ist so an der Leukämie-Entstehung maßgeblich beteiligt. Durch Kombination des von uns entwickleten zellbasierten Taspase1-Assays mit konfokaler Mikroskopie widmen wir uns nach der redefinition der genauen Schnittstelle nun dem bislang unerschlossenen Protease-Zielproteinen (TFII, USF2, MYO1F, EVI5, DPOLZ), um so die biologische Funktion von Taspase1 in soliden Tumoren wie in Entwicklungsprozessen aufzuklären. In Zusammenarbeit mit der Chemischen Biologie/AG Kaiser konnten wir zudem eine neue Klasse von Taspase1-Inhibitoren basierend auf einem Peptidylsuccinimidyl-Peptidmotiv identifizeren, welche vom propagierten Substrat-Spaltmechanismus abgeleitet wurden. Das Konfokal-Mikroskop ermöglichte erste Studien zur Zellgängigkeit der Substanzen und deren Derivate. AG Meyer, Projekt 1: Funktionelle Wechselwirkung von Cdc48/p97 und PP1: In diesem Projekt wurden mit Hilfe des Mikroskops die Regulation des Proteinphosphatase-1 (PP1) durch p97 sowie den Kofaktoren SDS22 und Inhibitor-1 während der Mitose in HeLa-Zellen untersucht. Wir konnten zeigen, dass SDS22 zwar notwendig für dir Funktion von PP1 am Kinetochore ist. SDS22 selbst muss jedoch von PP1 dissoziieren bevor PP1 and den Kinetochor rekrutiert wird, um die volle Aktivität von PP1 sicherzustellen. Weiterhin konnten wir zeigen, das Inhibitor-3 essentiell für die Aktivität von PP1 und die Dissoziation von SDS22 ist. Zur Zeit wird die Rolle von p97 in diesem Prozess untersucht. Für diese Studien war die hochauflösende und sensitive Messung von Einzelzellen mit dem SP5 Mikroskop essentiell. AG Meyer, Projekt 2: Analyse des VCP/p97 Kofaktor Netzwerkes: In diesem Projekt wird die Funktion und die dynamische Lokalisation von etwa 30 verschiedenen p97-Kofaktoren mit Hilfe des SP5 Mikroskops unter verschiedenen zellulären Stressbedingungen untersucht. Für diese Arbeiten ist vor allem die Screening-Funktion des Mikroskops essentiell, um zum einen die große Zahl der Proben in den Funktionsassays auszuwerten. Zum anderen nutzen wir die hochauflösende Bildgebung für Messung der dynamischen subzellulären Lokalisationsänderungen im Multiwell-Format. AG Nalbant: Rolle des Formin Proteins FHOD1 in Organisation von Stress-Fasern: Proteine der Formin-Familie regulieren die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts im Allgemeinen durch Stimulation der Polymerisation von Aktin-Fasern. In diesem Projekt konnte für den Fall des Formins FHOD1 jedoch u.a. durch Konfokal-Mikroskopie festgestellt werden, dass FHOD1 aus Aktin aufgebaute Stressfasern bündelt und spezifische Lokalisation an den Kappen der Fasern stabilisiert. Die Arbeit deckt die neuartigen Funktion eines zentralen Faktors für die lokales Organisation und Dynamik von Stressfasern auf, die für zelluläre Motilität wichtig ist. AG Ehrmann: In diesem Projekt wird die zelluläre Rolle der humanen Serin-Protease Htra1 bei Morbus Alzheimer untersucht. Gemessen wird die Dynamik von Amyloid-Fibrillen in Kulturzellen und im zellfreien System durch Konfokal-Mikroskopie. AG Gunzer: Dieses Projekt beschäftigt sich mit den zelldynamischen Aspekten von Immunreaktionen. Dabei werden die physiologischen Reaktionen verschiedenster Zelltypen (T-Zellen, B-Zellen, dendritische Zellen, neutrophile Granulozyten etc.) in den unterschiedlichsten Organen untersucht und molekulare Mechanismen hinter identifizierten Verhaltensmustern aufgeklärt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
-
Efficient Gene Delivery into Cells by a Surprisingly Small Three-Armed Peptide Ligand. Chem. Sci. 2012; 3, 996-1002
Kuchelmeister H.Y., Tillmann S., Gutschmidt A., Knauer S.K., Schmuck C.
-
Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nat. Nanotech. 2013; 8(10):772-81
Tenzer S., Docter D., Kuharev J., Musyanovych A., Fetz V., Hecht R., Schlenk F., Fischer D., Kiouptsi K., Reinhardt C., Landfester K., Schild H., Maskos M., Knauer S.K., Stauber R.H.
-
Ubiquitination of the N- terminal region of caveolin-1 regulates endosomal sorting by VCP/p97. J Biol Chem. 2013; 288(10):7363-72
Kirchner P, Bug M, Meyer H
-
Utilizing combinatorial chemistry and rational design: Peptidic tweezers with nanomolar affinity to DNA can be transformed into efficient vectors for gene delivery by addition of a lipophilic tail. Angew. Chem. Int. Ed. 2013; 52(52):14016-20
Kuchelmeister H.Y., Karczewski S., Gutschmidt A., Knauer S.K., Schmuck C.
-
Calcium phosphate increases the encapsulation efficiency of hydrophilic drugs (proteins, nucleic acids) into poly(D,L-lactide-coglycolide acid) nanoparticles for intracellular delivery. J. Mat. Chem. B. 2014 2:7250-59
Dördelmann G., Kozlova D., Karczewski S., Lizio R., Knauer S.K., Epple M.
-
FHOD1 regulates stress fiber organization by controlling the dynamics of transverse arcs and dorsal fibers. J Cell Sci. 2014; 127:1379-93
Schulze N, Graessl M, Blancke Soares A, Geyer M, Dehmelt L, Nalbant P
-
Inhibitor-3 ensures bipolar mitotic spindle attachment by limiting association of SDS22 to kinetochore-bound protein phosphatase 1.” EMBO J., 2014, 33:2704-20
Eiteneuer A., Seiler J., Weith M., Beullens M., Lesage B., Krenn V., Musacchio A., Bollen M., Meyer H.
-
Catchup: a mouse model for imaging-based. Nat Methods. 2015; 12(5):445-52
Hasenberg A., Hasenberg M., Männ L., Neumann F., Borkenstein L., Stecher M., Kraus A., Engel D.R., Klingberg A., Seddigh P., Abdullah Z., Klebow S., Engelmann S., Reinhold A., Brandau S., Seeling M., Waisman A., Schraven B., Göthert J.R., Nimmerjahn F., Gunzer M.
-
Very-late-antigen-4 (VLA-4)-mediated brain invasion by neutrophils leads to interactions with microglia, increased ischemic injury and impaired behavior in experimental stroke. Acta Neuropathol. 2015; 129(2):259- 77
Neumann J, Riek-Burchardt M, Herz J, Doeppner TR, König R, Hütten H, Etemire E, Männ L, Klingberg A, Fischer T, Görtler MW, Heinze HJ, Reichardt P, Schraven B, Hermann DM, Reymann KG, Gunzer M
-
Incorporation of a non-natural arginine analogue into a cyclic peptide leads to formation of positively charged nanotubes capable of gene transfection. Angew. Chem. Int. Ed. 2016; 55(2): 598–601
Li M., Ehlers M., Schlesiger S., Zellermann E., Knauer S.K., Schmuck C.
