Aufklärung der Katalysemechanismen und Regulation der bakteriellen Acetohydroxysäuresynthasen auf molekularer Ebene
Final Report Abstract
Die während des Projektzeitraums durchgeführten kinetischen und strukturellen Untersuchungen konnten das Verständnis für den Katalyse- und Regulationsmechanismus bakterieller AHAS erweitern. Für EcAHAS II konnte gezeigt werden, dass die Donorsubstratbindung und –spezifität durch die drei Aminosäureseitenketten Val375, Phe109 und Gln110 vermittelt wird. Dabei bilden Val375 und Phe109 zusammen mit einem Teil des FAD-Cofaktors eine hydrophobe Tasche, in die die Methylgruppe des Substrates bindet. Gln110 hingegen interagiert mit der Ketogruppe des Substrates. Durch den Austausch von Val375 konnte die Spezifität für das Donorsubstrat verändert werden, ohne dass die Substratspezifität in Akzeptorposition verändert ist. Eine Verkleinerung der Bindetasche resultierte in einer verschlechterten Bindung beider Substrate (Pyr, 2-KB). Die Alanin-Variante mit vergrößerter Bindungstasche zeigt eine geringere Affinität und Spezifität zum kleinen Substrat Pyruvat. Für das größere Substrat 2-KB konnte in dieser Variante eine Inversion der Affinität und Spezifität beobachtet werden. Aus den KD-Werten konnte ein ∆∆G b-Wert von 2.8 kJ/mol bestimmt werden, wobei dies der erwarteten Differenz in Hydrophobizität zwischen einer Methyl- und Ethylgruppe entspricht [6]. Im Wildtyp-Enzym wird die hohe Spezifität für Pyruvat in Donorposition durch die Destabilisierung von 2-Ketobutyrat in dieser Position gewährleistet. Phe109 und Gln110 sind jedoch nicht nur an der korrekten Bindung und Orientierung des Donorsubstrates beteiligt. Mutationen in diesen Seitenketten führen zu weiteren Beeinträchtigungen der Gesamtkatalyse. So kann in diesen Varianten eine Beeinträchtigung der Decarboxylierung und Produktabspaltung sowie veränderte Spezifität für das Akzeptorsubstrat beobachtet werden. Untersuchungen zum Regulationsmechanismus der EcAHAS I durch Valin ergaben, dass Valin der stärkste physiologische Inhibitor ist und zu einer Erhöhung des KM-Wertes und einer Verringerung der Katalysegeschwindigkeit führt. Die Einzelschrittanalyse konnte zeigen, dass die Bindung des Donorsubstrates der geschwindigkeistbestimmende Schritt der Gesamtkatalyse ist. In Gegenwart von Valin konnte keine Bindung des Donorsubstrates beobachtet werden. Experimente mit dem nicht-decarboxylierbaren Pyruvatanalogon MAP konnten eine Halbseitenreaktivität der AHAS nachweisen. Dabei sind beide aktive Zentren im CSU-Dimer chemisch nicht-äquvalent, wobei eines deutlich aktiver (catalytic site) ist als das andere (dormant site). Im Gegensatz zur E1-Komponente des humanen Pyruvatdehydrogenasekomplexes (PDH [11, 12]) scheint das Vorliegen verschiedener Enzymkonformationen die Ursache dafür zu sein [13]. Die Valinregulation erfolgt dabei durch einen Inhibitor-induzierten Konformationswechsel vom R-(Substratbindung möglich) zum T- state (Substratbindung blockiert) der aktiven Halbseite. Strukturelle Untersuchungen ergaben, dass rekombinante EcAHAS I mit ca. 300 kDa ein deutlich größeres Molekulargewicht hat als bisher angenommen. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass dieses Enzym in verschiedenen oligomeren Zuständen vorliegt. In Anwesenheit von Valin kann eine deutliche Abnahme des apparenten Molekulargewichts beobachtet werden (α4β8 α2β4). Unter Berücksichtigung, dass die RSU mit der β-Domäne der CSU interagieren [14], sollten die Dimere der RSU an der Peripherie des CSU-Dimers binden. Die durch Mutationsanalysen und Inhibierungsstudien vorgeschlagene Bindestelle von Valin in einer hydrophoben Bindetasche an der Kontaktfläche zweier RSU-Moleküle [15, 16] konnte indirekt bestätigt werden. Der hier gefundene positive ∆S-Wert (+ 11.1 cal/mal*K) kann durch die Zunahme der Entropie (die Störung der geordneten Wassermoleküle in Nähe der hydrophoben Bindetasche) erklärt werden. Der Informationstransfer vom Ort der Valinbindung in den RSU zum aktiven Zentrum verläuft sehr schnell und konnte auch in stopped-flow-Experimenten kinetisch nicht aufgelöst werden.
Publications
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(2008) Glyoxylate carboligase lacks the canonical active site glutamate of thiamine-dependent enzymes. Nature Chem. Biol. 4, 113-118
Kaplun, A., Binshtein, E., Vyazmensky, M., Steinmetz, A., Barak, Z., Chipman, D.M., Tittmann, K. , Shaanan, B.
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(2009) Origin of the specificities of acetohydroxyacid synthases and glyoxylate carboligase. J. Mol. Cat. B: Enzym. 61, 50–55
Chipman, D. M., Barak, Z., Shaanan, B., Vyazmensky, M., Binshtein, E., Belenky, I., Temam, V., Steinmetz, A., Golbik, R., Tittmann K.
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„Untersuchungen zum Katalyse- und Regulationsmechanismus Thiamin- und Flavinabhängiger Carboligasen aus Escherichia coli“. Dissertation, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, 07/2006-06/2009
Andrea Steinmetz
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(2010) Valine 375 and phenylalanine 109 confer affinity and specificity for pyruvate as donor substrate in acetohydroxy acid synthase isozyme II from Escherichia coli. Biochemistry 49, 5188-5199
Steinmetz, A., Vyazmensky, M., Meyer, D., Barak, Z. E., Golbik, R., Chipman, D.M., Tittmann K.
