Fluoreszenzbasiertes Durchflusszytometer mit Sortierfunktion und Einzelzellablage
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das bewilligte Großgerät erlaubt die Fluoreszenz-basierte Analyse von einzelnen Zellen, sowohl Bakterienzellen, als auch tierischen und menschlichen Zellen. Die besondere Eigenschaft des Gerätes ist es aber - im Anschluss an die Analyse - einzelne Zellen auszusortieren und kontrolliert abzulegen. Im Falle der tierischen oder menschlichen Zellen kann dies in normierte Zellkulturgefäße erfolgen, im Falle der Bakterien auf Agarplatten mit einem definierten Nährmedium. Im Anschluss können die Zellen vermehrt und weiter untersucht werden oder präparativ weiteren Anwendungen zugeführt werden. Dies alles geschieht im Hochdurchsatz, d.h. es können bis zu 70.000 einzelne Zellen pro s analysiert und ggfls. aussortiert werden. Dies erlaubt die Isolierung und Anreicherung einer bestimmten Zellpopulation aus einem komplexen und ggfls. stark verdünntem Gemisch, z.B. bestimmter Zellen des Blut-bildenden Systems oder Stammzellen. Es ermöglicht auch die Durchmusterung großer Bibliotheken von Bakterienzellen, die unterschiedliche Varianten eines bestimmten Proteins an der Oberfläche tragen, die durch Zufallsvariation erzeugt wurden und bildet damit in Form der Sortierung den Selektionsschritt beim Prozess der „Directed evolution“ oder der „Evolution im Reagenzglas“. In beiden genannten Anwendungsbeispielen ist das beschaffte Gerät unbedingte Voraussetzung, die entsprechenden wissenschaftlichen Projekte wären ohne das Gerät nicht durchführbar. In den ersten drei Jahren wurde das Gerät genutzt, um aus Oberflächen-exprimierten Antikörperfragment- Bibliotheken neue Varianten gegen vorgegebene Antigene (Epo, GLIA-2) zu identifizieren. Es wurden in Enzymbibliotheken neue Varianten mit verbesserten katalytischen Eigenschaften gefunden und aus Peptidbibliotheken neue Enzyminhibitoren für Wirkstofftargets (humane CK2, Cathepsin G) identifiziert. Darüber hinaus konnten Screeningverfahren für neuartige Inhibitoren, sogenannte Protein-Protein-Interaktions (PPI) Inhibitoren bei den humanen Tumortargets HSP90, Myb und Proteinkinase CK2 entwickelt werden, die erst durch die oben genannten Spezifikationen des Gerätes möglich geworden sind. Neben der schon genannten Isolierung definierter Zellen des Blut-bildenden Systems bei Drosophila und Mensch ist heraus zu heben, dass es auch gelungen ist, Zellorganellen im Hochdurchsatz zu sortieren und einer weiteren quantitativen Analytik der darin exprimierten Proteine zu zuführen. Das erlaubt u.a. die Untersuchung des Proteingehalts dieser Zellorganellen in Abhängigkeit der Wachstumsbedingungen für die Zellen. Neben den Gruppen am PharmaCampus der WWU Münster stammten in den letzten drei Jahren die häufigsten Nutzer aus dem Institut für Biochemie aus dem Fachbereich 12 Chemie und Pharmazie der WWU, aus dem Institut für Evolution und Biodiversität des Fachbereich Biologie und aus dem Institut für Medizinische Biochemie des Zentrums für Molekularbiologie der Entzündungserkrankungen (ZMBE) der WWU Münster. Darüber hinaus wurde das Gerät von unterschiedlichen Gruppen aus dem medizinischen Fakultät der WWU, weiteren Gruppen aus der Biologie und externen Gruppen, z. B. Mitarbeitern des Instituts für Biochemie der Universität zu Köln oder der Material Sciences der Yonsei Universität, Seoul genutzt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Autoantibodies to αS1-Casein are induced by breast-feeding. Plos One, 7:e32716
Petermann K, Vordenbäumen S, Maas R, Braukmann A, Bleck E, Saenger T, Schneider M, Jose J
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Autodisplay for the coexpression of lipase and foldase on the surface of E. coli: washing with designer bugs. Microb Cell Fact, 3:19
Kranen E, Detzel C, Weber T, Jose J
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Co-expression of active human cytochrome P450 1A2 and cytochrome P450 reductase on the cell surface of Escherichia coli. Microb Cell Fact, 15:26
Quehl P, Hollender J, Schüürmann J, Brossette T, Maas R, Jose J
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Design and biological testing of peptidic dimerization inhibitors of human Hsp 90 that target the C-terminal domain. BBA General subjects, 1860:1043-1055
Bopp B, Ciglia E, Ouald-Chaib A, Groth G, Gohlke H, Jose J
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First structure of protein kinase CK2 catalytic subunit with an effective CK2β-competitive ligand. ACS Chem Biol, 8:901-907
Raaf J, Guerra B, Neundorf I, Bopp B, Issinger O-G, Jose J, Pietsch M, Niefind N
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Human casein alpha s1 induces proinflammatory cytokine expression in monocytic cells by TLR4- signaling. Mol Nutr Food Res, 60:1079–1089
Vordenbäumen S, Saenger T, Braukmann A, Tahan T, Bleck E, Jose J, Schneider M
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Naphtol AS-E phosphate inhibits the activity of the transcription factor Myb by blocking the interaction with the KIX domain of the coactivator p300. Mol Cancer Ther, 14:1276-1285
Uttarkar S, Dukare S, Bopp B, Goblirsch M, Jose J, Klempnauer KH
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Proof of concept for the simplified breakdown of cellulose by combining Pseudomonas putida strains with surface displayed thermophilic endocellulase, exocellulase and ß-glucosidase. Micro Cell Fact, 15:103
Tozakidis IEP, Brossette T, Lenz F, Maas R, Jose J
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Site-specific labeling of protein kinase CK2: Combining surface display and click chemistry for drug discovery applications. Pharmaceuticals, 9, 36
Nienberg C, Retterath A, Becher K-S, Saenger T, Mootz HD, Jose J
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Targeting acute myeloid leukemia with a small molecule inhibitor of the Myb/p300 interaction. Blood, 127:1173-1182
Uttarkar S, Dassé E, Coulibaly A, Steinmann S, Jakobs A, Schomburg C, Trentmann A, Jose J, Schlenke P, Berdel WE, Schmidt TJ, Müller-Tidow C, Trampton J, Klempnauer KH
