Silver ion-doped calcium phosphate nanoparticles in a plasma clot matrix
Final Report Abstract
Im Rahmen dieses Projektes wurde eine Fibrin-Matrix aus humanem, zellfreien Blutplasma und silberdotierten Calciumphosphat-Nanopartikeln (AgCaP-NP) hergestellt und hinsichtlich der Eignung als Trägermatrix für humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) zur Behandlung von Knochendefekten in vitro untersucht. Ziel des Projektes war es, ein autologes, durch eingebettete AgCaP-NP gleichzeitig antimikrobiell und osteopromotiv wirkendes Biomaterial zu entwickeln, um zukünftig insbesondere Knochendefekte mit einer Infektion oder einem potenziellen Risiko einer Infektion im Rahmen einer zellbasierten Therapie behandeln zu können, wobei Silber antimikrobiell und Calciumphosphat osteopromotiv wirken sollte. Dieser ineinandergreifende Ansatz kombiniert somit optimal die Zelltherapie mit der Nanotechnology, um so eine neue Behandlungsmethode von infizierten Knochendefekten zu entwickeln. Im diesem Projekt wurde die Struktur der Plasmaclot-Matrix mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die Anwesenheit von hohen CaP-NP-Konzentrationen zur Ausbildung von dickeren Fibrinfasern führte. Die Analyse der Silberionenfreisetzung aus der Plasmaclot-Matrix mittels Atomabsorptionsspektroskopie ergab, dass ein Teil der Silberionen prinzipiell aus der Plasmaclot-Matrix freigesetzt wurde. Des Weiteren wurde der Einfluss von AgCaP-NP auf funktionale Eigenschaften der hMSC innerhalb der Plasmaclot-Matrix untersucht. Die Inkubation von hMSC in Anwesenheit unterschiedlicher AgCaP-NP-Konzentrationen führte zu einer konzentrationsabhängigen Beeinträchtigung der Viabilität und metabolischen Aktivität der eingebetteten hMSC. Die Inkubation der Zellen in Anwesenheit von hohen CaP-NP-Konzentrationen resultierte ebenfalls in einer Beeinträchtigung der Zellviabilität, was vermutlich auf die veränderte Clotstruktur zurückzuführen war. Zudem wurde die Aufnahme und intrazelluläre Lokalisation der CaP-NP in hMSC untersucht. Es wurde gezeigt, dass die verwendeten CaP-NP von hMSC innerhalb der Plasmaclot-Matrix konzentrationsabhängig aufgenommen wurden. Bakterien hingegen zeigten keine Aufnahme der CaP-NP. Da die Plasmaclot-Matrix sich nach Implantation in einen Knochendefekt nach einiger Zeit physiologisch auflösen würde, wurde zusätzlich die Funktionalität der hMSC nach Autolyse der Plasmaclot-Matrix in vitro untersucht. AgCaP-NP zeigten im subtoxischen Konzentrationsbereich keinen Einfluss auf die Viabilität und metabolische Aktivität von hMSC nach Autolyse der Plasmaclot-Matrix. In Bezug auf die osteogene Differenzierung zeigten die Ergebnisse, dass die osteogene Differenzierung in Anwesenheit von subtoxischen AgCaP-NP-Konzentrationen gefördert wird. Die antimikrobielle Aktivität der AgCaP-NP beladenen Plasmaclot-Matrix wurde an Gram-positiven Bakterien (S. aureus) und Gram-negativen Bakterien (E. coli) mittels Bakterien-Adhäsionstests, BacLight-Cytotoxizitätstest und Empfindlichkeitstestungen (Mikrodilutiontest, modifizierter Agardiffusionstest) ermittelt. Generell konnte gezeigt werden, dass AgCaP-NP einen silberkonzentrationsabhängigen Effekt auf Keime haben, wobei S. aureus unempfindlicher als E. coli war, vermutlich aufgrund der Unterschiede im Aufbau der Zellwände. E. coli zeigte in allen Versuche im Vergleich zu S. aureus in der Plasmaclot-Matirx auch in Abwesenheit von AgCaP-NP aufgrund der Serum-Bakterizidie der Plasmaclot-Matrix einen wachstumsinhibierenden Effekt. Des Weiteren konnte ein zeitabhängiger und keimzahlabhängiger Effekt der AgCaP-NP beladenen Plasmaclot-Matrix auf Keime gemessen werden, wobei mit zunehmender Inkubationszeit und sinkender Keimzahl die Bakterienadhäsion sowie das Wachstum an der Matrix reduziert werden konnte. Die ermittelten antimikrobiell wirksamen Konzentrationen für AgCaP-NP bzw. Ag-Acetat innerhalb der Plasmaclot-Matrix betrugen ≥5 µg/mL und lagen folglich in einem Konzentrationsbereich, der für hMSC auch zelltoxisch war (zelladverse Grenzwerte von Silber ≥5 µg/mL nach 3d). Generell zeigte sich, dass die hohe Proteinkonzentration im Plasmaclot durch Bindung eine effektive Freisetzung von Ag + aus der Plasmaclot-Matrix verhinderte, weshalb höhere Ag + -Konzentrationen innerhalb der Plasmaclot- Matrix eingesetzt werden mussten, um eine antimikrobielle Wirksamkeit zu erzielen. Die antimikrobielle Aktivität von Silber blieb auch nach Lyse der Plasmaclot-Matrix erhalten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass sich eine Fibrin-Matrix aus humanem Blutplasma und eingebetteten AgCaP-NP als Trägermatrix für hMSC zur Behandlung von infizierten Frakturen im Rahmen einer zellbasierten Therapie nur bedingt eignet. Der wesentliche Vorteil besteht darin, dass durch die Verwendung von autologem Plasma eine immunologische Abstoßungsreaktion verhindert wird. Die Fibrin-Matrix hält jedoch einen großen Teil der Silberionen durch Bindung an Plasmaproteinen zurück, weshalb die antimikrobielle Wirksamkeit der von AgCaP-NP freigesetzten Silberionen reduziert wird. Die verwendeten undotierten Calciumphosphat-Nanopartikel in einer Plasmaclot-Matrix eignen sich prinzipiell als osteopromotives Biomaterial.
Publications
- Silver iondoped calcium phosphate nanoparticles and human mesenchymal stem cells within a plasma clot matrix for fracture therapy. BioNanoMaterials 14 (2013):105
K. Sivalingam, J. Ruesing, C. Greulich, M. Epple, T. Schildhauer, M. Köller
- Silver-doped calcium phosphate nanoparticles: Synthesis, characterization, and toxic effects towards mammalian and prokaryotiv cells. Colloids and Surfaces B 2013; 1202:724-729
Peetsch A, Greulich C, Braun D, Stroetges C, Fiethen A, Kuhn H, Rehage H, Siebers B, Köller M, Epple M
(See online at https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2012.09.040) - Eine silberdotierte Calciumphosphat-Nanopartikel-haltige Plasmaclot-Matrix als Träger für mesenchymale Stammzellen. German Medical Science GMS (2015)
C. Sengstock, J. Rüsing, M. Epple, TA. Schildhauer, M. Köller
(See online at https://dx.doi.org/10.3205/15dkou557)
