2-Photonenmikroskop für Intravitalmikroskopie im Tiermodell
Final Report Abstract
Das beschaffte 2-Photonenmikroskop ist speziell für die intravitale Mikroskopie im Kleintier ausgelegt. Es wurde nach Inbetriebnahme zunächst technisch charakterisiert (Punktbildfunktion, Detektorrauschen, Kalibrierung etc.). Es wurden optimale Scanparameter ermittelt für den normalen Betrieb (Gewebs-Autofluoreszenz + mehrere eingebrachte Farbstoffe) sowie für spezielle Abbildungsmodi (SHG, THG, 3-Photonenanregung, HDR, Photoncounting). Da Bilddaten der 2-Photonenmikroskopie prinzipbedingt mit einem hohen Photonenrauschen behaftet sind, wurden spezielle Software-Algorithmen entwickelt und publiziert, die das Rauschen entfernen, die relevante Bildinformation aber erhalten. Daneben werden z.Zt. Algorithmen entwickelt, mit denen Bewegungsartefakte rechnerisch soweit kompensiert werden, dass quantitative Analysen, u.a. zur Migrationsgeschwindigkeit von Lymphozyten, nicht verfälscht werden. Das bereits zuvor in Lübeck entwickelte Mausmodell zur intravitalen Mikroskopie von Darmschleimhaut wurde im Jenaer Labor des Antragstellers erfolgreich etabliert und verbessert (OP-Technik, Lagerungsbühne, Applikationstechnik). Es erlaubt, an narkotisierten Tieren im Final-End-Versuch, für typisch 7–9 Stunden dynamische Vorgänge in Schleimhäuten in Form von Volumen-Zeitserien in 4 spektralen Kanälen und mit bis zu 3 Anregungswellenlängen aufzuzeichnen. Es wurden bis jetzt vor allem Untersuchungen an Dünndarmschleimhaut, daneben auch an Magen, Caecum und Colon durchgeführt. Als dynamischer Prozess ist vornehmlich die Migration von Lymphozyten innerhalb des Epithels und der Lamina propria von Interesse, daneben die zelluläre und subzelluläre Dynamik der Epithelzellen. Eine wesentliche neue Beobachtung wurde von uns am lymphatischen Gewebe des Dünndarms, an den Peyerschen Plaques, gemacht. Nach den bisherigen Vorstellungen besteht zwischen dem Darmlumen und den intraepithelialen Lymphozyten kein direkter Kontakt. Durch spezialisierte Epithelzellen, die sog. M-Zellen, wird ständig antigenes Material durch Transzytose aufgenommen und in Kontakt zu Zellen des Immunsystems gebracht. Wir haben nun beobachtet, dass die M-Zellen regelmäßig Poren oder Tunnel in ihrem apikalen Zytoplasma ausbilden, durch die Lymphozyten das Darmlumen direkt kontaktieren. Sie greifen mit beweglichen Zytoplasmaausläufern für 2–20 min in das Darmlumen. Einige Zellen (5–10%) wandern vollständig ins Darmlumen und kehren nach 3–16 min durch die selbe Pore in die Mukosa zurück. Nur < 25% aller Lymphozyten gehen zum Lumen hin verloren. Da Dextran als Flüssigphasemarker entlang des Spalts zwischen Lymphozyt und M-Zelle nicht in das Gewebe eintritt, bleibt die Barriere intakt. Durch Applikation von Kernfarbstoff ins Darmlumen konnten wir zeigen, dass die Lymphozyten durch M-Zell-Poren tatsächlich in direkten Kontakt zum Lumen kommen. Die Applikation von CD-Antikörpern ins Darmlumen ergibt eine starke Membranmarkierung von etwa 85% aller Lymphozyten durch B-Zell-Marker und von etwa 15% durch T-Zell-Marker. Granulozyten, Makrophagen und dendritische Zellen waren bei insgesamt über 200 M-Zellporen und über 400 beobachteten luminalen Kontakten praktisch nicht beteiligt. Der neue Mechanismus könnte eine effektive Methode darstellen, B-Lymphozyten in Kontakt mit luminalen Antigenen zu bringen, um T-Zell-unabhängige B-Zell-Antworten auszulösen. In anderen Projekten wird die Migration von intraepithelialen Lymphozyten in Dünndarmzotten sowie im Oberflächen- und Kryptenepithel des Dickdarm quantitativ untersucht. Hierbei ist die Hypoxiesituation und die Reaktion auf lokale Epithelschäden von besonderem Interesse. Für die dargestellten Befunde ist die Auslegung des beschafften 2-Photonenmikroskops von vorrangiger Bedeutung. So werden typischerweise sowohl Gewebs-Autofluoreszenz als auch 2–3 weitere eingebrachte Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig angeregt und die Emissionen in 4 spektralen Kanälen getrennt. Bei vergleichsweise hoher Scangeschwindigkeit (15 sec pro Bildstapel bei 400 x 400 x 30 Pixel) muss durch maximale Detektorempfindlichkeit die phototoxische Schädigung so gering sein, dass Serien von 100–200 Zeitpunkten in Form von großen Datensätzen (2–4 GB) sicher aufgezeichnet und gespeichert werden. Das beschaffte System erfüllt sämtliche Anforderungen auf ideale Weise.
Publications
- Data-adaptive image-denoising for detecting and quantifying nanoparticle entry in mucosal tissues through intravital 2-photon microscopy. Beilstein J Nanotechnol (2014) 5:2016–2025
Bölke T, Krapf L, Orzekowsky-Schroeder R, Vossmeyer T, Dimitrijevic J, Weller H, Schüth A, Klinger A, Hüttmann G, Gebert A,
(See online at https://doi.org/10.3762/bjnano.5.210)
