Multiphotonen-Mikroskop mit in-vitro-Setup
Final Report Abstract
Ausbau für in-vivo Verfahren. Es hat sich in der Zeit von Beantragung zur Beschaffung des Gerätes eine substantielle Entwicklung im wissenschaftlichen weiteren und engeren Umfeld stattgefunden. Im Zuge dieser Entwicklungen wurden in-vivo Untersuchungen insbesondere an wachen Tieren zu einer hochkompetitiven Methode. Diese Methoden erlauben es, die Relevanz der Aktivität spezfischer Netzwerkmotive für Verhalten gezielt zu untersuchen. Im näheren Umfeld ergab sich v.a. im Rahmen der ersten Förderperiode des SFB1089 ein immer grösserer Bedarf an der breiten Etablierung von Methoden für in-vivo 2P- Ca2+ imaging an wachen Tieren. Diese Entwicklung war ein wichtiger Teil der wissenschaftlichen Entwicklung am Standort und im SFB 1089, und wurde in vielen Gruppen vorangetrieben. Der Charakter der Fragestellungen im gerade begutachteten Folgeantrag des SFB1089 hat sich entsprechend geändert - die meisten Projekte beinhalten nun zusätzlich zu in-vitro Verfahren auch in-vivo Analysen mit Hilfe von 2P- Ca2+ imaging. Infolge dieser Entwicklung wurde die ursprüngliche Zielsetzung ein in-vitro System zu etablieren aufgegeben, und die Mikroskopstage für in-vivo Experimente konzipiert und um ein lineares Laufband für Experimente an wachen Tieren ergänzt. Ansonsten unterscheidet sich das System nicht von der initialen Planung. Wir haben im Zuge der schnellen Entwicklung im Feld beschlossen i) Imagingverfahren direkt an wachen, kopffixierten Tieren zu etablieren, ii) dies mit eine virtuellen linearen Umgebung zu kombinieren sowie iii) direkt mit der Entwicklung von tiefen Imagingverfahren zu beginnen, die eine Messung neuronaler Aktivität z.B. im Gyrus dentatus erlauben (ca. 2mm unter der kortikalen Oberfläche). Entsprechend haben wir die folgenden technologischen Entwicklungen seit Dezember 2014 abgeschlossen. Entwicklung von tiefem Imaging. Im Zuge des Projektplanes war es notwendig, von tiefen Strukturen abzuleiten (Gyrus dentatus des Hippokampus). Die Etablierung dieser Technologie ist gelungen, es kann routinemässig von 400-500 Neuronen im Gyrus dentatus in wachen Tieren abgeleitet werden. Dies ist sowohl mit intakter CA1 Region, als auch nach Exkavation von den über dem Gyrus dentatus liegenden kortikalen und hippokampalen Strukturen gelungen. Enscheidende Schritte für ein qualitativ gutes Imaging war die Entwicklung einer neuen Kopfixierung und eines kranialen Fensters, das auch bei tiefen Strukturen eine Konservierung einer hohen numerischen Apertur erlaubt. Zusätzlich ist Imaging im Kortex sowie der CA1 Region etabliert worden. Entwicklung von dual-color Imaging. Wie an dem Partnersystem haben wir kürzlich auch an diesem System gleichzeitiges Imaging mit GCaMP6s sowie rotgeshifteten Indikatoren (jRGECO) in wachen Tieren etabliert. Dies hat z.B. erlaubt die Aktivität in afferenten axonalen Systemen zu detektieren, gleichzeitig mit dem Imaging der Zellaktivität. Hierfür war die Einkopplung und Justage eines zweiten, langwelligen Faserlasers notwendig (1050 nm, Fidelity, Coherent). Entwicklung eines linear Track für Experimente an wachen Tieren. Es wurde ein lineares Laufband für Experimente an wachen Tieren entwickelt. Das Laufband erlaubt die Generierung präzise definierter polysensorischer Umgebungen (somatosensorisch, akustisch, optisch, olfaktorisch). Das System erlaubt die zeitlich koordinierte Registrierung von Imagingdaten, sowie von Laufgeschwindigkeit, Position auf dem Laufband, Pupillendurchmesser mit Hilfe von Pupillometrie. Es wurde ein integriertes System mit zentraler Steuerung durch LabView entwickelt. Analyse: Die Analyse komplexer Imagingdaten wurde inklusive Korrektur von Bewegungsartefakten (Steadyscan Matlab toolkit), der Detektion von Zellen mit Aktivität (nichtnegativen Matrixfaktorisierungs-basierter Algorithmus), sowie von Custom-Algorithmen in Matlab etabliert. Komplexere Algorithmen (Deep Learning) sind in Kooperation mit theoretischen Gruppen (Prof. Schmid) in der Entwicklung. Zur Analyse wurde ein Prozessorcluster etabliert (32 Kerne), das eine schnelle Auswertung mit Matlab erlaubt.
