Hammerhead Ribozyme: Funktionsanalyse pflanzlicher Motive und Etablierung einer Internet-basierten Datenbank
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Hammerhead Ribozyme (HHRz) sind kleine katalytische RNA Motive. Natürliche Motive weisen tertiäre Wechselwirkungen zwischen Haarnadelschleifen in zwei von drei Helices auf, die den katalytischen Kern konservierter Nucleotide umgeben. Ihre Konservierung wurde ursprünglich in minimalen Versionen ohne die tertiären Wechselwirkungen etabliert. Während diese Sequenzanforderungen im Allgemeinen auch für natürliche Versionen gelten, haben wir herausgefunden, dass es hier Unterschiede für die HHRz-Schnittstelle N17 gibt. Ein Guanosin an dieser Position beeinträchtigt die Spaltungsaktivität in Minimalversionen stark, wohingegen wir für die G17-Varianten von vier tertiär stabilisierten HHRz eine signifikante Spaltungs- und Ligationsaktivität in vitro beobachten. Kinetische Analysen dieser Varianten zeigen eine reduzierte Geschwindigkeit und ein geringeres Ausmaß der Spaltung im Vergleich zu Wildtyp-Sequenzen, während Varianten mit gestörten tertiären Wechselwirkungen mit geringerer Geschwindigkeit, aber in gleichem Maße gespalten wurden. Im Gegensatz dazu weisen G17-Varianten eine ähnliche in vitro Ligationsaktivität auf wie das entsprechende Wildtyp-Motiv. Um auch die katalytische Aktivität dieser Motive in vivo zu zeigen, haben wir HHRz-Kassetten in das lacZ-Gen eingefügt und den resultierenden β-Galaktosidase-Reporter in Dictyostelium discoideum getestet. In kolorimetrischen Assays beobachten wir Unterschiede in der enzymatischen Aktivität von β-Galactosidase, die gut mit der Aktivität der verschiedenen HHRz-Varianten in vitro korrelieren und durch Primerverlängerungsanalyse eindeutig der Ribozymspaltung zugeschrieben werden können. Somit ist die Definition der Spaltungsstelle natürlicher HHRz Motive weniger starr als ursprünglich angenommen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2013) G17-modified Hammerhead Ribozymes are active in vitro and in vivo. RNA, 19, 1595-1604
Kalweit, A. and Hammann, C.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1261/rna.040543.113) - (2016). Hammerhead ribozymes going viral. Kommentar. In Genome Biology 17, 136
Hammann C.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1186/s13059-016-1007-z)
