Multi-Photonen Erweiterung für Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Unter abiotischen wie auch biotischen Stresssituationen aktivieren Pflanzen S-Typ (slow)-Anionenkanäle der SLAC/SLAH-Familie, die daraufhin den Ausstrom von Anionen wie Chlorid und Nitrat vermitteln. Die daraus resultierende Depolarisation der Membran, die oft von einem Calcium-Signal begleitet ist, löst dann eine Signal-abhängige physiologische Reaktion der Pflanze aus. In den letzten Jahren konnten wir durch eine Kombination aus Proteinbiochemie, Elektrophysiologie und diversen Protein-Protein Interaktionsstudien die Signalkette von der Stress- Perzeption bis zur Aktivierung dieser Schlüsselschalter auf molekularer Ebene lückenlos aufklären. In Schließzellen wird als Antwort auf Trockenstress das Pflanzenhormon ABA synthetisiert und vermittelt über eine schnelle ABA-Signaltransduktionskette die Aktivierung von den S-typ Anionenkanälen SLAC1 und SLAH3. Daraufhin schließen sich die Blattporen/Stomata und kein wertvolles Wasser geht mehr verloren. Durch die Expression in Xenopus Oozyten als auch in planta, konnten wir die beteiligten S-Typ-Anionenkanäle funktionell charakterisieren und ihre Regulation studieren. Großangelegte Interaktionsstudien mit der BiFC- und FRET-Technik sowie die funktionelle Rekonstitution in vitro und in Xenopus Oozyten zeigten, dass die Aktivität der Anionenkanäle über einen Komplex aus ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), Proteinphosphatasen des PP2C-Typs (ABI1 und 2) und über Proteinkinasen (OST1, CPK21/23) ABA-abhängig reguliert werden. Im Zentralzylinder der Wurzel exprimieren Pflanzen die Anionenkanäle SLAH1 und 3. Der von uns bereits funktionell in Oozyten charakterisierte Anionenkanal SLAH3 leitet hauptsächlich das Anion Nitrat (die wichtigste Stickstoffquelle von Pflanzen) und trägt über die Beladung der Wasser/Nährsalz-Leitgefäße in der Wurzel maßgeblich zur Stickstoffernährung der Pflanze bei. Der S-Typ Anionenkanal SLAH1 blieb in Oozyten allerding elektrisch stumm. Über die Regulation dieser Anionenkanäle in der Wurzel und die physiologische Funktion von SLAH1 war bis vor kurzem kaum etwas bekannt. Erst durch den Einsatz des Multiphotonenlasers und der FRET-FLIM-Technik konnten wir durch Co-expression von SLAH1 und SLAH3 in transient transformierten Tabakblättern eine physikalische Interaktion dieser beiden Anionenkanal-Untereinheiten zweifelsfrei beweisen. Funktionelle Untersuchungen in Xenopus Oozyten zeigten schließlich, dass SLAH1 und SLAH3 in der Lage sind heteromere Anionenkanalkomplexe zu bilden, wodurch SLAH3 Phosphorylierungs-unabhängig aktiviert wird - ein Aktivierungsmechanismus, der völlig anders als der ABA-Signalweg in Schließzellen funktioniert. Interessanterweise ging die Aktivierung von SLAH3 durch SLAH1 mit einer dramatischen Steigerung der Chloridpermeabilität von SLAH3-vermittelten Anionenströmen einher. Aufwendige Struktur-Funktionsuntersuchungen demonstrierten schließlich, dass SLAH1 auch im Komplex mit SLAH3 selbst keine Leitfähigkeit besitzt, aber die Selektivität und Aktivierbarkeit von SLAH3 modifiziert. Welche physiologische Rolle spielt die Aktivierung von SLAH3 durch die Heteromerisierung mit SLAH1 und die daraus resultierende Chloridleitfähigkeit des Komplexes? SLAH1 und SLAH3 Verlustmutanten wiesen sich beide durch eine 50 %ige Reduktion des Chloridgehalts im Spross aus. Da Chlorid genauso wie Natrium in höheren Konzentrationen toxisch für Pflanzen ist, führten wir Salzstress-Experimente durch. Es zeigte sich, dass bei Salzstress die Expression der SLAH1 Untereinheit nahezu vollständig inhibiert ist. In anderen Worten unter Salzstress verliert die Pflanze ihre Aufnahmekapazität für Chlorid (schütz sich vor toxischen Chloridkonzentrationen), kann aber dennoch ihre Versorgung mit dem essentiellen Makronährstoff Nitrat durch die Präsenz von SLAH3 aufrechterhalten. Nutzung des Multi-Photonenlasers: Bei unseren Untersuchungen von Transportprozessen an pflanzlichen Membranen hat sich der Multiphotonenlaser in Kombination mit dem FRET/FLIM Modul als wertvolles und mittlerweile unersetzliches Tool bewiesen. Dynamische Protein-Protein Wechselwirkungen können Artefakt-frei untersucht werden und zelluläre sowie subzelluläre Lokalisationsstudien in planta lassen sich auch in tief-gelegenen Geweben ohne ein zu starkes Ausbleichen des Fluorophors realisieren.
Publications
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Arabidopsis nanodomain-delimited ABA signaling pathway regulates the anion channel SLAH3. PNAS 2013; 110(20): 8296-8301
Fatih Demir, Claudia Horntrich, Jörg O. Blachutzik, Sönke Scherzer, Yvonne Reinders, Sylwia Kierszniowska, Waltraud X. Schulze, Gregory S. Harms, Rainer Hedrich, Dietmar Geiger and Ines Kreuzer
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Silent S-type anion channel subunit SLAH1 gates SLAH3 open for chloride root-to-shoot translocation. Curr Biol 2016; 26(16): 2213-2220
Paloma Cubero-Font, Tobias Maierhofer, Justyna Jaslan, Miguel A. Rosales, Joaquín Espartero, Pablo Díaz-Rueda, Heike M. Müller, Anna-Lena Hürter, Khaled A.S. AL- Rasheid, Irene Marten, Rainer Hedrich, José M. Colmenero-Flores, Dietmar Geiger
