Vollautomatisierte Mikroskopie-basierte zelluläre High-Content Analyse Plattform für Lebendzell-Mikroskopie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Mikroskopie-basierte zelluläre High-Content Analyse (HCA) Plattform wurde und wird für wissenschaftliche Fragestellungen im Rahmen eigener Forschungs- als auch Kooperationsprojekten der AG Prof. Rothbauer (pharmazeutische Biotechnologie, Universität Tübingen) und AG Prof. Volkmer (Neurobiologie, NMI) vornehmlich für (i) zellbasierte Wirkstoffanalysen, (ii) phänotypische Charakterisierung intrazellulär funktionaler Antikörper-Fragmente (Chromobodies), (iii) Entwicklung neuer Zellmodellen zur Wirkstoffforschung (iv) Bestimmung von Synapsen in primären Neuronen und (v) Neuriten-Wachstums-Analysen induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) genutzt. Seit Inbetriebnahme wurden in allen Bereichen Forschungsergebnisse erzielt, welche im Folgenden kurz skizziert werden. (i) HCA basierte Wirkstoffanalysen. Zur Identifikation und Klassifizierung neuer Inhibitoren der p38-MAPK wurde ein zellbasierter Wirkstoffscreen mit einer kombinatorischen Bibliothek von 3362 Kinase-Inhibitoren (Prof. Laufer, Pharmazie, Uni.-Tüb.) etabliert. Hierzu wurden U2OS-Zellen hergestellt, die stabil eine GFP-Fusion des MAPKAP2 Proteins (MK2-GFP) exprimieren. Nach Inhibition von p38-MAPK kommt es in diesen Zellen zu einer veränderten nukleärenzytoplasmatischen Translokation von MK2-GFP. Dies wurde genutzt um Wirkstoffeffekte mittels High-Content Imaging und automatischer Bildsegmentierung (Nukleus vs Cytoplasma) im 96-well Format zu bestimmen. Auf Basis eines primären Screens aller 3362 Wirkstoffe im Duplikat wurden 23 Hits selektiert von denen entsprechende Dosis-Wirkungskurven in Echtzeitanalysen mittels der HCA-Plattform bestimmt wurden. (ii) Phänotypische Charakterisierung von Chromobodies. Hierzu wurden in zwei Forschungsprojekten Chromobody-Bibliotheken gegen beta-Catenin und Vimentin hergestellt. Zur Testung der intrazellulären Bindungseigenschaften wurden HeLa-Zellen im 96-well Format mit RFP-markiertem Antigen in Kombination mit GFP-markierten Chromobodies im Hochdurchsatz transfeziert und in der HCA-Plattform mikroskopiert. Zur Bestimmung der intrazellulären Antigenbindung wurden mittels des Custommoduleditors (CME) Algorithmen erstellt und entsprechende zelluläre Strukturen segmentiert. Die intrazelluläre Chromobody-Bindung wurde durch die Kolokalisation der unterscheidbaren fluoreszierenden Signale (Antigen/Chromobody) bestimmt. Im Ergebnis wurden damit in beiden Forschungsprojekten Chromobodies identifiziert, welche die endogenen Zielstrukturen in Echtzeit visualisieren. (iii) Entwicklung neuer Chromobody Zellmodelle für die Wirkstoffforschung. Hierzu wurden beta-Catenin als auch Vimentin spezifische Chromobodies stabil in humane Zellenmodelle (HeLa, A549) eingebracht. Zur Validierung in der Wirkstofftestung wurden diese Zellmodelle im 96-well Format ausgebracht, mit Wirkstoffen behandelt und eine Echtzeit-Bildakquise und Auswertung in der High-Content Analyse Plattform durchgeführt. Damit konnten bis dato drei Zellmodelle zum Nachweis des Zellzykluses, der Translokation von beta- Catenin und der Induktion der epithelialen mesenchymalen Transition (EMT) entwickelt und validiert werden. (iv) Für die Quantifizierung von postsynaptischen Strukturen in Zellkulturen wurde das Gerät für eine Diplomarbeit und eine Masterarbeit eingesetzt. Hierzu wurden im 96-well Format in primären Neuronen die Anzahl von Synapsen mittels Antikörperfärbungen bestimmt um durchsatzfähige Assays zu entwickeln. (v) Aktuell wird das Gerät auch für die Charakterisierung induzierter, pluripotenter Stammzellen (iPSCs) genutzt. Hierzu wurde auf Basis des „Neurite-Outgrowth Moduls“ eine Routine zur Bestimmung des Neuritenwachstums im 96-well Format etabliert. Diese Arbeiten sind Teil einer Dissertation.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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A p38 substrate-specific MK2-EGFP translocation assay for identification and validation of new p38 inhibitors in living cells: a comprising alternative for acquisition of cellular p38 inhibition data. PLoS One; 2014; Apr 17;9(4):e95641
Anton R, Bauer SM, Keck PR, Laufer S, Rothbauer U
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Live imaging of endogenous protein dynamics in zebrafish using chromobodies. Development; 2015; May 15;142(10):1879-84
Panza P, Maier J, Schmees C, Rothbauer U, Söllner C
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Monitoring interactions and dynamics of endogenous beta-catenin with intracellular nanobodies in living cells. Mol Cell Proteomics; 2015; Mar;14(3):707-23
Traenkle B, Emele F, Anton R, Poetz O, Haeussler RS, Maier J, Kaiser PD, Scholz AM, Nueske S, Buchfellner A, Romer T, Rothbauer U
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Real-time analysis of epithelial-mesenchymal transition using fluorescent nanobodies. Scientific Reports; 2015; 5:13402
Maier J, Traenkle B, Rothbauer U
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A Multiplexed High-Content Screening Approach Using the Chromobody Technology to Identify Cell Cycle Modulators in Living Cells. J Biomol Screen. 2016; April 4
Schorpp K, Rothenaigner I, Maier J, Traenkle B, Jung M, Rothbauer U, Hadian K
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From Enzyme to Whole Blood: Sequential Screening Procedure for Identification and Evaluation of p38 MAPK Inhibitors. Methods Mol Biol.; 2016;1360:123-48
Bauer S.M, Kubiak J.M, Rothbauer U, Laufer SA
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IPSC-derived neurons as a cellular model system for neuropsychiatric disorders. SfN Jahrestagung, San Diego 2016
Grunwald LM, Kriebel M, Eberle M, Kraushaar U, Battke F, Singh Y, Fallgatter AJ, Volkmer HJ
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Peptides in headlock – a novel high-affinity peptide-binding nanobody for proteomics and microscopy. Scientific Reports; 2016; 6:19211
Braun M.B, Traenkle B, Koch P.A, Emele F, Weiss F, Poetz O, Stehle T, Rothbauer U
