Kryopräparationssystem
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die beantragte Gerätekombination aus Hochdruckgefriereinrichtung und Kryosubstitutionsanlage wurde am Elektronenmikroskopischen Zentrum insbesondere im Rahmen immunelektronenmikroskopischer Analysen in Zusammenarbeit mit verschiedenen Arbeitsgruppen eingesetzt. In unserer eigenen Arbeitsgruppe liegen gute Erfahrungen mit der Charakterisierung von Zelladhäsionmolekülen und immun-elektronenmikroskopische Vorarbeiten zur Expression von E-Cadherin und anderen Markern der Zelldifferenzierung vor. Mit einem kombinierten Einsatz der Hochdruckgefrieranlage und der Kryosubstitution haben wir nach entsprechenden Vorversuchen das Ziel verfolgt, eine gute Erhaltung der Zellstruktur und der Antigenizität für immunelektronenmikroskopische Untersuchungen im ‘post-embeddding‘ Verfahren auf Methacrylatharzen zu erzielen. Derzeit untersuchen wir dazu verschiedene Gewebe, darunter Lungen- und Trachealepithel, Leberzellkulturen und Lebergewebe, um die Expression von E-Cadherin und weiteren zellulären Markern als Maß für die Integrität und Reifung der Epithelien bzw. Zellkulturen darzustellen. Die Untersuchung der Morphologie sporenbildender Bakterien, wie z. B. Clostridium acetobutylicum (Zusammenarbeit mit der Abt. Mikrobiologie, Institut für Biowissenschaften Universität Rostock), stellt eine präparative Herausforderung dar, weil die bakterielle Zellwand und der starke Sporenmantel die Entwässerung der Proben beeinträchtigen. Dies ist insbesondere bei der Einbettung in hydrophile Kunstharze für immun-elektronenmikroskopische Anwendungen problematisch, da eine Nachfixierung der Proben mit Osmiumsäure aufgrund der Beeinträchtigung der Antigenizität nicht in Betracht kommt. Durch die Kryopräparation mit beiden Techniken war eine besonders schonende Entwässerung und Harzinfiltration der Bakterien und Sporen möglich, die anschließend eine sehr gute, spezifische Immunlokalisation und sogar eine quantitative Untersuchung eines säurelöslichen Sporenproteins (SASPs) im Wildtyp und bei einer SASP Defektmutante mit stark reduziertem Gehalt an SASPs erlaubte. Die Auswertung zeigte, dass das betreffende SASP fast ausschließlich im Nucleoid des Sporenkerns vorlag und dass bei der Defektmutante eine kritische Menge an SASPs, die für die vollständige Entwicklung neuer Bakterienzellen notwendig ist, offenbar unterschritten wurde.
