Influence of nuclear architecture on gene vector persistence and expression
Final Report Abstract
Retroviren und retrovirale Vektoren sichern die Transkription Ihrer Gene, indem sie in das Genom der Wirtszelle stabil integrieren. Retroviren wie HIV sind wichtige Krankheitserreger von Mensch und Tier. Retrovirale Vektoren werden dagegen als Genfähren für Gentherapien eingesetzt. Trotz der wichtigen Rolle, die retrovirale Integrationen also spielen, sind ihre Auswirkungen auf die mikroskopisch sichtbare Struktur des Chromatins im Zellkern bisher kaum untersucht worden. In dem Projekt haben wir eine solche Untersuchung durchgeführt, indem wir retrovirale Integrationen in strukturell erhaltenen Zellkernen verschiedener menschlicher und Mauszell-Linen untersuchten. Mit Hilfe einzeln getesteter Sonden wurde die chromosomale DNA um den Integrationsort durch Fluoreszenzin-situ-Hybridisiemng (FISH) dargestellt und mit konfokaler Mikroskopie dokumentiert. Die Sonde stellt gleichzeitig den homologen Genort auf dem unveränderten homologen Chromosom dar, so dass dieser als Kontrolle dienen kann. Um beide unterscheiden zu können wurde die DNA des Virus oder Vektors ebenfalls als Sonde verwendet und in einer anderen Farbe dargestellt. Dreidimensionale Bilder wurden anschließend einer quantitativen digitalen Bildanalyse unterzogen. Unsere Untersuchungen ergaben, dass eine retrovirale Integration in einigen, aber nicht in allen Fällen dazu führte, dass der entsprechende Genort im Vergleich zur Kontrolle auf dem homologen Chromosom weiter Richtung Kerninneres lag. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass im Kerninneren genreiche und teilweise auch transkribierte Chromatinregionen häufiger anzutreffen sind, während genarme oder nicht transkribierte Regionen eher Richtung Peripherie liegen. Des Weiteren ist ein zwei Fällen eine Dekondensation des die Integrationsstelle umgebenen Wirtschromatins aufgetreten. Wir konnten also zeigen, dass eine retrovirale Integration von nur einigen tausend Basenpaaren Größe eine mikroskopisch nachweisbare Veränderung der Chromatinstruktur einer endogenen chromosomalen Region hervorrufen kann.
Publications
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2007. Quantitative comparison of DNA detection by GFP-lac repressor tagging, fluorescence in situ hybridization and immunostaining. BMC Biotechnol. 7:92
Kim, I.H., J. Nagel, S. Otten, B. Knerr, R. Eils, K. Rohr, and S. Dietzel
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2010. Mediator subunits: gene expression pattern, a novel transcript identification and nuclear localization in human endothelial progenitor cells. Biochim Biophys Acta. 1799:487-495
Rienzo, M., J. Nagel, A. Casamassimi, A. Giovane, S. Dietzel, and C. Napoli
