Untersuchungen zur Regulation des hepatozellulären Natrium-abhängigen Methotrexat-Transporters
Final Report Abstract
Das Chemotherapeutikum Methotrexat, ein Folsäureantagonist, ist ein seit vielen Jahren eingesetztes Therapeutikum bei verschiedenen Tumoren im Brust- und Kopfbereich, bei akuten Leukämien und bei Osteosarkomen. Weitere wichtige Einsatzgebiete von MTX liegen in der Therapie der Psoriasis oder der rheumatoiden Arthritis. Das Wirkprinzip von MTX beruht insbesondere auf einer Inhibition der intrazellulären Dihydrofolatreduktase, welche die für die Nukleotidsynthese notwendigen C1-Bausteine liefert, so dass es zu einer Inhibition der Nukleotidsynthese kommt. Die Elimination von MTX erfolgt hauptsächlich unmetabolisiert über Niere und Leber. Für die Pharmakokinetik des Arzneimittels (Resorption, Verteilung und Elimination) wie auch für die Pharmakodynamik (intrazellulärer Wirkort) ist ein vektorieller Transport des Fremdstoffs, der unter physiologischen Bedingungen als Anion vorliegt, eine wesentliche Voraussetzung. Diese Transportvorgänge werden mit Hilfe einer Reihe von passiven Carriern (Carrier zur erleichterten Diffusion) und dem von uns an Rattenhepatozyten identifizierten Natrium-abhängigen und damit sekundär aktiven Methotrexattransporter realisiert. Dieses Transportprotein wurde identifiziert, charakterisiert und aus Rattenleberzellen kloniert. Im Folgeprojekt haben wir den entsprechenden cDNA-Klon aus der Rattenniere kloniert, eingehend funktional charakterisiert, weitere alternative Splicingprodukte identifiziert, kloniert und auf ihre Funktionalität überprüft. Ferner haben wir mit Hilfe bakterieller Expressionssysteme spezifische Antiseren generiert und die Topologie sowie die Gewebeverteilung des Transporters untersucht. Besonderes Augenmerk lag jedoch auf Untersuchungen zur Regulation des Transporters, da bereits auf der cDNA-Ebene Regulationselemente für Induktoren vom Phenobarbital- und 3-Methylcholanthrentyp, gefunden wurden. Mit dem leberähnlichen in vitro Model HPCT-1E3 konnte die Regulation des Carriers durch Induktoren vom Phenobarbitaltyp auf funktionaler Ebene gezeigt und damit bereits vorhandene in vivo Daten bestätigt werden. Mittlerweile konnten wir den zugrunde liegenden molekularen Mechanismus der Regulation mit modernsten Methoden (Life Cell Imaging) detailliert aufschlüsseln. Wir konnten zeigen, dass diese Regulation nicht auf der RNA- oder Proteinebene ausgeübt wird, sondern posttranslationale Modifikationen des Transportproteins eine Rolle spielen, die letztendlich zu einer Internalisierung des Transportproteins führen. Mit Hilfe dieser Daten gelang es somit nicht nur Arzneimittelinteraktionen, die klinisch relevant sind, aufzudecken, sondern auch den Wirkmechanismus zu erklären. Es besteht die realistische Hoffnung, dass diese Daten zu einem verbesserten Therapieregime bei der klinischen Anwendung von Methotrexat führen werden. Zudem konnten wir anhand einer in vivo Studie an Ratten erstmalig zeigen, dass die funktionelle Aktivität des hepatozellulären Methotrexattransporters ebenso durch Induktoren vom 3-Methylcholanthrentyp wie TCDD reguliert wird. Im Vergleich zur Phenobarbitalbedingten Regulation liegt hier interessanterweise jedoch ein anderer molekularer Mechanismus der Rfc1 Regulation vor. So konnten wir zeigen, dass die nach TCDD- Exposition beobachtete Reduktion der Transporteraktivität auf einer AhR-abhängigen verminderten Rfc1-Transkriptionsrate und Proteinmenge beruhte. Diese Daten sind insbesondere deshalb von praktischer Relevanz, da der Rfc1 neben Methotrexat ebenfalls das zentrale Transportsystem für Folsäurederivate darstellt. Die Folsäure, ein wasserlösliches Vitamin aus dem B-Komplex, gehört als Ko-Faktor für die Biosynthese von Nukleinsäuren und Proteinen zu den essentiellen Nährstoffen des Menschen und anderer Säugetiere. Eine Unterversorgung mit Folaten kann zu megaloblastären Anämien, Neuralrohrdefekten bei Neugeborenen und Hyperhomocysteinämien, ein kardiovaskulärer Risikofaktor, führen. Unsere Daten tragen somit zum Verständnis des molekularen Mechanismus bei, wie persistente Umweltschadstoffe wie Dioxine nicht nur die Pharmakokinetik von Methotrexat und damit die MTX-Chemotherapieeffizienz beeinflussen, sondern ebenso Einfluss auf physiologische Transportvorgänge wie die lebenswichtige Versorgung des Organismus mit Folaten haben. Die unerwünschte Reprimierung des Rfc1-Transporters durch Umweltschadstoffe trägt somit zur bereits laut der deutschen Gesellschaft für Ernährung bestehenden latenten Folat-Unterversorgung eines Großteils der deutschen Bevölkerung bei. Somit können die Daten dieses Projektes ebenfalls zu einer Verbesserung des Verbraucherschutzes beitragen.
Publications
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Alternative transcripts of rat slc19a1: Defective sorting and inefficient expression of alternative splicing products- an addendum. DNA Sequence, 17, 83-86 (2006)
Schrader, S., Kneuer C., Said, H.M., and W. Honscha
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Adaptive response to increased bile acids: induction of MDR1 gene expression and P-glycoprotein activity in renal epithelial cells. Eur. J. Phys., 454, 587-594 (2007)
Kneuer, C., Honscha, W., Gäbel, G., and K.U. Honscha
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Downregulation of the reduced folate carrier transport activity by phenobarbital-type cytochrome P450 inducers and protein kinase C activators. Biochim. Biophys. Acta –Biomembranes, 1768, 1671-1679 (2007)
Halwachs, S., Kneuer, C., and W. Honscha
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Antiepileptic drugs reduce efficacy of methotrexate chemotherapy by downregulation of Reduced folate carrier transport activity. Leukemia, (2009) [Epub ahead of print]
Halwachs, S., Schäfer, I., Seibel, P., and W. Honscha
