Beobachtung der Rotationsmechanik einer einzelnen FoF1-ATP Synthase im ABELtrap

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Börsch
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 230720104

FoF1-ATP Synthasen produzieren und erhalten das [ATP]-Niveau in Zellen mithilfe eines mechano-chemischen Mechanismus, der eine interne Rotation von Untereinheiten nutzt. Wir haben bisher die schrittweise Rotation der gamma- und epsilon-Untereinheiten im F1-Teil und des c-Rings im Fo-Teil einzelner Enzyme untersucht. Zwei Untereinheiten wurden spezifisch mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, um interne Abstandsänderungen mit Hilfe des Förster Resonanz Energie Transfers (FRET) zu verfolgen. Unser konfokaler Einzelmolekül-FRET Ansatz nutzte frei-diffundiernde Enzyme, die in Liposomen mit einem Durcmesser von etwa 120 nm rekonstituiert waren. Die mittele Durchgangszeit der Proteoliposomen von etwa 30 ms durch das Detektionsvolumen schränkte die Untersuchungen der Untereinheiten-Rotation auf eine ATP Konzentration von 1 mM für ATP Hydrolyse und auf sehr hohe Delta_ph- und Delta_psi-Werte für ATP Synthese ein.Die Arbeitsgruppe von W. E. Moerner in Stanford hat eine "Anti-Brown'sche elektrokinetische Falle" ('ABELtrap') entwickelt, die ein kleines fluoreszierendes Partikel (bspw. ein Protein) in einer mikrofluidischen Struktur bis zu 10 Sekunden an einem Ort festhalten kann. Einzelmolekül-FRET-Experimente im ABELtrap erlauben die Beantwortung der offenen Fragen nach möglichen Zwischenschritten der 120° Rotation der epsilon-Untereinheit bei niedrigeren ATP-Konzentrationen, ob die Verweilzeiten der c-Untereinheiten bei den sequentiellen 36°-Schritten gleich oder verschieden sind und wie die interne elastische Verformung der beiden aneinander gekoppelten Rotor-Untereinheiten mit angemessener statistischer Basis belegt werden kann.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: USA
• Beteiligte Person: Professor W.E. Moerner