Identifikation RNA G-Quadruplex bindender Proteine und Untersuchung der biologischen Relevanz der Protein-RNA G-Quadruplex Interaktion

• Antragsteller: Professor Dr. Jens Kurreck
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 232393904

Guanine-Quadruplexe (G-Quadruplexe, GQ) in RNA Molekülen wurden kürzlich als wichtige regulatorische Elemente der Genexpression beschrieben. Als Strukturmotive in den 5' UTRs zahlreicher mRNAs blockieren sie die Proteinbiosynthese, ohne das Level der mRNA zu verändern. Hierbei handelt es sich um eine partielle Inhibition der Translation, sodass das Ausmaß der Repression vermutlich durch weitere Faktoren reguliert wird. In dem beantragten Projekt soll untersucht werden, welche Proteine an GQs binden und wie hierdurch zelluläre Prozesse beeinflusst werden.Unsere Gruppe konnte erstmalig nachweisen, dass ein GQ in der 5' UTR eines Tumor-relevanten Gens (zic-1) die Translation in eukaryontischen Zellen inhibiert. In weiterführenden Arbeiten, die in Interaktion mit dem hier beschriebenen Ansatz fortgesetzt werden sollen, konnten wir für zwei exemplarisch ausgewählte GQs (in den mRNAs von ARPC2 und MMP16) zelluläre Proteine identifizieren, die mit diesen interagieren. Um ein umfassenderes Bild von der Relevanz der GQs zu erhalten, sollen nun die GQs in den mRNAs von NRAS und Bcl-2 untersucht werden. Die GQs variieren in Sequenz und Aufbau, sodass Unterschiede in den Interaktionen mit zellulären Partnern zu erwarten sind. Vor allem aber spielen NRAS und Bcl-2 eine wichtige Rolle bei der Zellproliferation und Apoptose, sodass untersucht werden soll, welche Bedeutung Protein-GQ-Interaktionen durch die Regulation der Proteinsynthese für diese Prozesse haben.Ein zentraler Schritt des Projektes ist die Identifikation der GQ-bindenden Proteine mittels Pull-Down Assays mit anschließender massenspektrometrischer Analyse (MALDI-TOF). Durch die Verwendung mehrerer GQ-Strukturen können Proteine mit der generellen Fähigkeit, an diese Strukturen zu binden, von solchen unterschieden werden, die spezifisch für ein bestimmtes GQ sind. Anschließend sollen die identifizierten Proteine rekombinant exprimiert und aufgereinigt werden, um in vitro Bindungskonstanten mittels Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie zu bestimmen. Durch in vitro Proteinbiosynthese-Versuche, bei denen ein Luciferase-Reporter unter Kontrolle eines GQ-Motivs in der 5' UTR gebildet wird, soll untersucht werden, in welchem Maße die Kandidatenproteine die Translation blockieren und ob es eine Korrelation zwischen der Bindungsstärke und dem Ausmaß des inhibitorischen Effektes gibt. Durch Überexpression bzw. RNA Interferenz-vermitteltes Silencing der Interaktionspartner soll dann in vivo überprüft werden, welchen Effekt die GQ-bindenden Proteine auf die Translation haben.Im abschließenden Teil des Projektes sollen die biologischen Effekte der Interaktionen zwischen den identifizierten Proteinen und den RNA GQs untersucht werden. Hierbei soll die Regulation zentraler zellulärer Prozesse wie der Proliferation und Apoptose durch die Stabilisierung bzw. Destabilisierung der jeweiligen GQ-Strukturen und die daraus folgende Modulation der Translation von NRAS und Bcl 2 analysiert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen