Transport von "tail-anchored" Proteinen zur inneren Kernmembran

• Antragsteller: Professor Dr. Ralph Kehlenbach
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 234233342

Der Zellkern ist von zwei Membranen, der inneren und der äußeren Kernmembran, umgeben, die über die Kernporen miteinander in Verbindung stehen. Über den Transport von Membranproteinen zur inneren Kernmembran (INM, inner nuclear membrane) ist vergleichsweise wenig bekannt. Man ging lange davon aus, dass Membranproteine passiv über die Kernporen zur INM diffundieren und dort dann durch Interaktion mit Proteinen der Kernlamina zurückgehalten werden. Es scheint jedoch auch die Möglichkeit eines aktiven Transports zu geben, der nach ähnlichen Prinzipien erfolgt wie der Transport von löslichen Proteinen durch die Kernpore. Besondere Faktoren, die zum Transport von Membranproteinen zur INM benötigt werden, sind bisher jedoch nicht bekannt. Zur Untersuchung des Transports von Proteinen zur INM wollen wir die besonderen Eigenschaften einer Klasse von Proteinen ausnutzen, den sogenannten tail-anchored Proteinen (TA-Proteine). Diese Proteine haben eine einzige Transmembrandomäne, die sich am äußersten C-Terminus befindet. Sie werden nicht über den klassischen, SRP/Sec61-abhängigen Weg co-translational in die ER-Membran integriert, sondern post-translational, nach erfolgter Synthese. Dies ermöglicht es uns, die Proteine in Bakterien zusammen mit einem Chaperon (TRC40) zu exprimieren und zu reinigen. Als Model-Proteine haben wir bisher die INM-Proteine Emerin und LAP2 (lamina associated polypeptide 2) verwendet. Wir konnten zeigen, dass sich diese Proteine wie TA-Proteine verhalten, da sie in einem etablierten Assay posttranslational in Mikrosomen-Membranen integrierten. In Digitonin-permeabilisierten Zellen konnte mCherry-Emerin, das zuvor als fluoreszierendes Reporterprotein im Komplex mit TRC40 gereinigt worden war, erfolgreich in ER-Membranen und in die INM eingebaut werden. Wir planen nun, diesen neuen in vitro Assay zu nutzen, um den Transport von Emerin, LAP2 und anderen TA- Proteine zur INM biochemisch zu charakterisieren. Zunächst werden wir die Rolle von Faktoren untersuchen, deren Funktion beim Transport von löslichen Proteinen in den Zellkern bereits gut charakterisiert ist. Später soll der in vitro Assay verwendet werden, um mögliche zytosolische Faktoren zu identifizieren, die am Transport der verschiedenen Substrate beteiligt sind. Neben diesem Assay in permeabilisierten Zellen sollen verschiedene Ansätze in intakten Zellen verfolgt werden. So werden wir zunächst weitere Proteine der INM untersuchen, deren Sequenzeigenschaften eine Klassifizierung als TA-Proteine vermuten lassen. Schließlich soll eine mikroskopische Methode etabliert werden, die eine Quantifizierung des Proteintransports zur INM in vivo und in vitro erlaubt. Zusammenfassend werden unsere Arbeiten zum besseren Verständnis der Biogenese der inneren Kernmembran beitragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen