Characterisation of the xanthine oxidase protein family in Arabidopsis: biochemistry and physiological importance for the synthesis of phytohormones, ureides, and reactive oxygen species
Final Report Abstract
Zu den pflanzlichen Molybdän-haltigen Enzymen der Xanthinoxidase-Familie zählen die Xanthindehydrogenase (XDH) und die Aldehydoxidase (AO), die in verschiedenen Pflanzenspezies jeweils mit unterschiedlich vielen Isoformen vertreten sind. So finden sich in Arabidopsis vier AO-Gene, AAO1 - AAO4, die nicht nur homodimere Proteine mit bestimmten Substratpräferenzen, sonderen auch heterodimere Proteine mit überlappenden Substratpräferenzen hervorbringen. Auf diese Weise nehmen pflanzliche AO-Proteine prominente Aufgaben u. a. in der Synthese von Phytohormonen (ABA, IAA) sowie in der Synthese von Benzoesäure zur Inkorporation in Glucosinolaten war. Gleichzeitig besitzt Arabidopsis zwei XDH-Gene, AtXDH1 und AtXDH2, wovon jedoch nur AtXDH1 ein aktives Protein hervorzubringt. AtXDH1 ist das Schlüsselenzym des Purin-Catabolismus, wo es Hypoxanthin zu Xanthin und Xanthin zu Harnsäure durch Oxidation abbaut, wobei die dabei frei werdenden Elektronen auf NAD+ überträgen werden und dadurch NADH entsteht. Zwar war bereits vor Beginn dieses Projektes bekannt, dass AtXDH1 in Abwesenheit von NAD+ die aus dem Purin-Substrat gewonnenen Elektronen unter Bildung von Reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) auch auf molekularen Sauerstoff übertragen kann, jedoch fehlten bis dahin sowohl der In vivo-Nachweis als auch die physiologische Bedeutung einer solchen ROS- Produktion. Ebenso verhielt es sich mit der alternativen Aktivität der AtXDH1, über die unter bestimmten Bedingungen NADH oxidiert werden kann, wobei auch hier durch die Übertragung der frei werdenden Elektronen auf molekularen Sauerstoff ROS gebildet werden. Die Arbeiten im Rahmen dieses Projektes haben zeigen können, dass AtXDH1 mit diesen Aktivitäten eine kritische Rolle sowohl in der Synthese von ROS für Stress-Signaling und Pathogenabwehr, als auch in der Eliminierung von ROS während der Stressantwort zum Schutz vor oxidativen Schäden einnimmt. Dies wird erreicht durch die räumlich Trennung der gegensätzlichen Aktivitäten "Harnsäure-Bildung" und "ROS-Produktion durch NADH- Oxidation", die den ROS-Metabolismus während einer Pathogenabwehrreaktion in für die Pflanze günstiger Weise modulieren. So bildet AtXDH1 über ihre NADH-Oxidaseaktivität in mit Echtem Mehltau infizierten Blatt-Epidermiszellen zusammen mit den NADPH-Oxidasen RbohD und RbohF Superoxidradikale, die durch Superoxiddismutasen in H2O2 umgesetzt werden. Die Anreicherung von H2O2 am pilzlichen Haustorium innerhalb infizierter Epidermiszellen hemmt das Haustorium und fördert dadurch die Resistenz gegenüber dem Erreger. Im Gegensatz dazu führt AtXDH1 in Blatt-Mesophyllzellen derselben infizierten Pflanzen ihre "normale" Aktivität aus, indem sie Harnsäure in lokalen und systemischen Geweben bildet. Als ROS-Scavenger fängt Harnsäure das während des Pathogenstresses in Chloroplasten gebildete H2O2 ab und bewahrt so infizierte Pflanzen vor Stress-induziertem oxidativen Schaden. Eine mit der Purindegradation in Verbindung stehende Bedeutung der XDH für die vegetative und generative Entwicklung der Pflanze oder damit assoziierter Aspekte wird aktuell kontrovers diskutiert. Unter „normalen“ Anzuchtbedingungen konnte für Arabidopsis konnte gezeigt werden, dass die XDH-Aktivität mit Beginn der natürlichen Blattseneszenz steigt und diese während der gesamten Seneszenzphase sehr hoch ist. Daraus ließe sich ableiten, dass die XDH oder auch ihr Reaktionsprodukt (Harnsäure) für die Initiation der Seneszenz eine entscheidende Rolle spielt. Allerdings zeigen XDH-Mutanten unter denselben Bedingungen neben einer beschleunigten Blattseneszenz auch ein allgemein verringertes Wachstum. Da in höheren Land- und Nutzpflanzen bisher noch keine XDH-defizienten Mutanten beschrieben wurden, haben wir in unseren Studien am Modell Tomate Behandlungen mit dem XDH-Inhibitor Allopurinol durchgeführt. In Gegenwart hoher Allopurinol-Konzentrationen kam es dabei zu einer vollständigen Inhibierung der XDH in Keimlingen bzw. Jungpflanzen, begleitet von einer stark ausgeprägten Blattvergilbung bzw. Chlorophyllverlust. Dieser „Seneszenz-Phänotyp“ legt nahe, dass das Fehlen jeglicher XDH- Aktivität auch in Tomate eine verfrühte Blattseneszenz verursacht. Über den Nachweis molekularer Seneszenz-Marker werden dieses Ergebnis überprüft. Im Gegensatz dazu konnte im Ansatz mit geringeren Allopurinol-Konzentrationen gezeigt werden, dass bei einer partiellen Hemmung der XDH ohne sichtbaren Chloropyhllverlust die generative Entwicklung der Pflanze stark verzögert ist. Offenbar werden hier die Ausbildung von Knospen, das Blühverhalten sowie die Fruchtentwicklung durch eine reduzierte bzw. misregulierte XDH-Aktivität direkt oder indirekt beeinflusst. Zusammengefasst legen diese aktuellen Daten nahe, dass der pflanzlichen XDH eine zentrale Rolle im Zuge des Recycelns von Stickstoffverbindungen (Purine/Ureide) und Energieäquivalenten (NADH) zu Gute kommt, die in bestimmten vegetativen und generativen Entwicklungsphasen regulierend wirkt.
Publications
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