Using super resolution imaging to investigate the photodynamic inactivation of pathogenic microorganisms
Medical Physics, Biomedical Technology
Parasitology and Biology of Tropical Infectious Disease Pathogens
Final Report Abstract
In Deutschland sterben jährlich 15.000 Menschen an Krankenhauskeimen wie MRSA. Neben der Entwicklung neuartiger Antibiotika werden auch andere Verfahren zur Bekämpfung von pathogenen Mikroorganismen intensiv erforscht. Eines davon ist die photodynamische Inaktivierung von Mikroorganismen (PDI). Da die relevanten Mikroorganismen für Untersuchungen mit konventionellen Fluoreszenzmikroskopen zu klein sind (~ 1 µm), gibt es noch deutliche Lücken im grundlegenden Verständnis der Wirkmechanismen der PDI. Um die PDI bei möglichst vielen Mikroorganismen effektiv einsetzen zu können, ist die Kenntnis der subzellulären Lokalisation chemisch unterschiedlicher PS und deren Wirkung von entscheidender Bedeutung (Struktur-Wirkungsprinzip). In diesem Forschungsprojekt wurden höchstauflösende Techniken der Fluoreszenzmikroskopie (PALM/STORM), der Elektronenmikroskopie (TEM) und der Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet, die eine Bildgebung jenseits der lichtmikroskopischen Auflösung ermöglichen und mit spektroskopischen und photobiologischen Methoden korreliert. Für das Projekt wurden neue Photosensibilisatoren (PS) entwickelt und synthetisiert, die auf den Grundchromophoren TMPyP und MB beruhen, um das Struktur-Wirkungsprinzip in Abhängigkeit der chemischen Struktur besser zu verstehen. Interessanterweise zeigte sich, dass eines der Derivate MB3 mit jeweils zwei zusätzlichen Ladungen selektiv Gram-negative E. coli abtötet und keine antibakterielle Aktivität gegenüber S. aureus bei gleichen Konditionen zeigt. Im Projektverlauf konnte die subzelluläre Lokalisation der PS mit Hilfe der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Im Gegensatz zum bisherigen Ansatz mit photoschaltbaren Farbstoffkonjugaten konnte die Lokalisation der PS über deren Fluoreszenz mit hochsensitiven Detektoren untersucht werden. Gleichzeitig wurde mit einem Marker die Zellwand angefärbt, um die subzelluläre Lokalisation der PS erstmals zu bestimmen. Es zeigte sich, dass die PS vor Bestrahlung noch außerhalb der Bakterien befinden und erst durch Bestrahlung eine Schädigung stattfindet, die das Eindringen des PS erlaubt. Um die Dynamik des PS zu untersuchen, wurde die Laserleistung variiert und es zeigte sich, dass bei einer höheren Bestrahlungsdosis sich die latente Phase (Schädigung der Membran) verkürzt, sprich die Schädigung der äußeren Membran vermutlich schneller von statten geht und sich der Prozess der Diffusion des PS und z. B anschließender Bindung an zelluläre Bestandteile wie Proteine, die einen Anstieg der Fluoreszenzintensität begünstigen, beschleunigt wird, und nach Erreichen des Maximums der Fluoreszenzintensität der PS schneller ausbleicht. Um die photobiologischen und photophysikalischen Experimente zu verifizieren und den Ort der Schädigung einzugrenzen, wurden zusätzlich elektronenmikroskopische Untersuchungen durchgeführt. Es zeigte sich bei der Methodenentwicklung, dass zunächst eine ausreichende Menge an Mikroorganismen notwendig ist, um deren Schädigung abzubilden und quantitativ auszuwerten. Es konnte bei Sporen als auch bei vegetativen Bakterien gezeigt werden, dass eine morphologische Veränderung bereits direkt nach der photodynamischen Behandlung detektiert werden kann. Durch die Korrelation der Ergebnisse aus den mikroskopischen, spektroskopischen und photobiologischen Untersuchungen entsteht die notwendige wissenschaftliche Basis für eine Weiterentwicklung und Optimierung der photodynamischen Inaktivierung von Mikroorganismen.
Publications
- Luminescence spectroscopy of singlet oxygen enables monitoring of oxygen consumption in biological systems consisting of fatty acids. Physical Chemistry Chemical Physics, 2013; 15 (27): 11386-11393
Gollmer A, Regensburger J, Maisch T, Bäumler W
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Cieplik F, Späth A, Regensburger J, Gollmer A, Tabenski L, Hiller KA, Bäumler W, Maisch T, Schmalz G
(See online at https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2013.07.031) - Maisch T, Eichner A, Spaeth A, Gollmer A, König B, Regensburger J, Baeumler W, Fast and effective photodynamic inactivation of multiresistant bacteria by cationic riboflavin derivatives. PLOS ONE, 2014, 9(12): e111792
Maisch T, Eichner A, Spaeth A, Gollmer A, König B, Regensburger J, Baeumler W
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Gollmer A, Felgentraeger A, Baeumler W, Maisch T, Spaeth A
(See online at https://doi.org/10.1039/c4pp00309h) - Fast and effective inactivation of Bacillus atrophaeus endospores using light-activated derivatives of vitamin B2. Photochemical & Photobiological Sciences, 2015, 14: 387-396
Eichner A, Gollmer A, Spaeth A, Baeumler W, Regensburger J, Koenig B, Maisch T
(See online at https://doi.org/10.1039/c4pp00285g)
