Multi-Photonen Laser-Scan/Light Sheet Mikroskop
Final Report Abstract
Das über diese Fördermittel angeschaffte Multiphotonen (2p) Mikroskop ist in 3 Hauptkomponenten aufgeteilt, welche getrennt aber auch in Kombination genutzt werden können. 1. Der gepulste Multiphotonenlaser mit zwei parallelen Laserlinien zur Fluoreszenzanregung (1. Laser-Linie 680 bis 1300 nm einstellbar; 2. Laser-Linie 1040 nm fest) welcher sowohl das Scan-Mikroskop als 2. Komponente des Aufbaus wie auch (parallel) das Light Sheet Mikroskop (Eigenbau) als 3. Komponente des Gesamtaufbaus geregelt & dosiert bedienen bzw. beleuchten kann. Alle diese drei Komponenten sind zusammen auf einem vibrationsgedämpften optischen Tisch installiert. Die Arbeitsgruppe Odermatt als Hauptnutzer und Hauptantragsteller des Mikroskop-System war bei Inbetriebnahme des Mikroskops als Nachwuchsgruppe (NRW Rückkehrer) in ihre ersten Aufbauphase und ist mittlerweile (seit dem 1. Feb. 2018) als feste Arbeitsgruppe in der Neuroanatomie der Medizinischen Fakultät (Uni Bonn) verstetigt. Bei dem 2p Light Sheet Mikroskop Setup ist der Aufbau, Etablierung und Charakterisierung der Kenndaten des Mikroskops an sich schon als ein Forschungsergebnis zu betrachten, da solch ein ultraschnelles 3D Mikroskop dieser Art für unsere Anwendung an der lebenden Zebrafischlarve so weder bisher etabliert wurde noch kommerziell erhältlich ist. Bisher wurden eine Doktorarbeit sowie eine Masterarbeit für den praktischen Aufbau und die Testung des gebauten Mikroskops in Kollaboration mit der AG von Prof. Kubitscheck (Physikalische Chemie, Uni Bonn) angefertigt. Des weiteren ist zur Zeit eine zweite Dr.-Arbeit für die finale Testung des Mikroskops und Etablierung der Aufnahmesoftware sowie der Abschließenden Beschreibung und Veröffentlichung der erlangten Aufnahmeparameter und gewonnene Erfahrungen mit dem neuen 2p Light Sheet Mikroskop-Setup am laufen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die lebende immobilisierte Fischlarve bis zu Tag 5 nach Befruchtung in einem frei wählbaren Bild-Ausschnitt von 0,3 x 0,3 mm in zwei fluoreszenten Farben (grün & rot) gleichzeitig in einer Auflösung von 0,5 x 0,6 x 1,5 (µm) (X x Y x Z) in weniger als 3 Sek. komplett als Bildstapel (60 Bilder – Abstand in Z freiwählbar) aufgenommen werden kann. Dies entspricht einer ca. 20- fachen Geschwindigkeitssteigerung z.B. im Vergleich zum oben beschrieben Scan-Mikroskop bei gleicher Auflösung. Die ersten bereits veröffentlichten Poster zu diesem Mikroskop sind an diesen Bericht angehängt. Erwähnenswert ist hierbei die hochauflösende (räumlich und zeitlich) Untersuchung von Kalziumänderungen in einzelnen Nervenzellen der Fischlarve z.B. mittels des genetisch codierten Kalziumreporters GCaMP6. Hierin liegt nun allerdings leider auch ein Grund für Verzögerungen bei den ersten Veröffentlichungen von Ergebnissen mit Hilfe des angeschafften 2p-Mikroskops – wir mussten leider dann Feststellen, dass die Expression eines anderen fluoreszenten genetisch codierter Glutamat-Reporter (iGluSnFr) die natürliche Entwicklung des Myelins im CNS der Fischlarven beeinträchtigt – wahrscheinlich durch die Ab-Pufferung von freiem Glutamat, welches als Signalmolekül bei der Myelinisierung dient, durch den Reporter selbst – dies sind wir zur Zeit aber genauer am Untersuchen. Ein weiteres CNS Myelin Projekt bei welchem das angeschaffte 2p-Mikroskop und auch schon das Light-Sheet Setup zur Anwendung für in vivo Aufnahmen der verwendeten Reporter-Fischlinien kam ist das 36K Myelin-Protein Projekt von B. Nagarajan. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor GPR17 wird in Zusammenarbeit mit der AG Prof. Kostenis (Institut für Pharmazeutische Biologie, Uni Bonn) mit Hilfe des angeschafften 2p-Mikroskopsetups (Scan & Light Sheet) von uns zur Zeit auf seine Auswirkung auf die Myelinisierung des ZNS im Zebrafisch in vivo untersucht. Hierbei gab es anfänglich Probleme mit Antikörpern, der quantitativen rt-PCR in Fischlarven sowie gab es Diskrepanzen zwischen Morpholino Knock-Down und CRISPR/Cas9 Knock-Out Ergebnissen, diese wurden aber mittlerweile geklärt. Die genetischen Ursachen von urogenitalen Fehlbildungen während der menschlichen embryonalen Entwicklung ist ein Forschungsschwerpunkt welcher in Kollaboration mit der AG von Prof. Reutter mit mikroskopischen in vivo Untersuchungen an Zebrafischlaven in meiner AG neu hinzu gekommen ist. Aus dieser gemeinsamen Forschung sind zwei Projekte zu erwähne, welche das 2p-Setup intensive nutzen bzw. genutzt haben. Zum einen das BNC2 Projekt der medizinischen Doktorandin C. Kolvenbach und das Slc20A1 Projekt von M. Schmidt. Seit Anfang 2018 ist die AG Odermatt darüber hinaus federführend für den Betrieb der Zebrafisch Core Facility der Medizinischen Fakultät der Uni Bonn verantwortlich und die (Mikroskop) Nutzung des 2p-Setups wird in diesem Rahmen von unserer Core-Facility allgemein angeboten und unterstützt.
