The impact of ovarian stimulation on the cellular epigenome and proteome during mouse development
Final Report Abstract
Im Rahmen dieses Projekts sollte der Einfluss der ovariellen Stimulation auf die Methylierung von geprägten Genen während der Maus-Entwicklung bestimmt werden. In der Anfangsphase des Projektes wurden zunächst mit Hilfe der klassischen Bisulfitsequenzierung umfangreiche Daten zur Methylierung von geprägten Genen in Oozyten und Präimplantationsembryonen der Maus erhoben. Im Rahmen von aufwändigen Validierungsexperimenten wurde allerdings festgestellt, dass die klassische Bisulfit- Sequenzierung aufgrund der in vielen Fällen beobachteten bevorzugten Amplifikation von einzelnen oder wenigen Ziel-DNA-Molekülen keine ausreichend repräsentativen Ergebnisse bei der Methylierungsuntersuchung von Präimplantationsembryonen mit geringen Zellzahlen liefert. Da den Methylierungsuntersuchungen dieser Embryonalstadien eine essenzielle Schlüsselrolle im Rahmen des Projekts zukam, wurde der Hauptfokus der daran anschließenden Arbeiten zunächst auf die Entwicklung einer hierfür geeigneten, absolut verlässlichen Methode gelegt und auf die Methylierungsanalyse von Postimplantationsembryonen sowie von verschiedenen Geweben von Feten, neonatalen, juvenilen und adulten Mäusen komplett verzichtet. Im weiteren Projektverlauf gelang es uns dann, mit der „Limiting Dilution“-Bisulfit-Pyrosequenzierung eine innovative Methode zu entwickeln, die zur Klärung unserer Fragestellung hervorragend geeignet ist. Diese Methode weist zudem ein hohes Potenzial zur Methylierungsanalyse von wenigen Zellen im Rahmen von anderen Projekten und Fragestellungen z.B. im Bereich Tumor- oder Stammzellforschung auf. Mit Hilfe dieser Methode konnten wir nachweisen, dass die Superovulation mit einem Verlust der Methylierung des maternalen Snrpn-Allels assoziiert ist und möglicherweise auch die Methylierung des paternalen H19-Allels beeinflusst. Ergänzend zu diesen Untersuchungen wurde eine ebenfalls innovative und für andere Fragestellungen durchaus auch relevante RT-PCR-Methode zum Multiplex-Nachweis von mRNAs in einzelnen Präimplantationsembryonen und Blastomeren etabliert. Unter Einsatz dieser Methode konnten wir signifikante Unterschiede in der mRNA-Expression der putativen Reprogrammierungsgene Apex1, Mbd3 und Polb zwischen Embryonen aus superovulierten und Embryonen aus spontan ovulierten Verpaarungen beobachten, die auch auf Proteinebene nachweisbar waren. Unsere Daten sprechen für somit für einen moderaten Einfluss der Superovulation auf die Methylierung von geprägten Genen in Präimplantationsembryonen der Maus, der möglicherweise durch die gestörte Expression von putativen Reprogrammierungsgenen vermittelt wird.
Publications
- (2009) Multiplex RT-PCR Expression Analysis of Developmentally Important Genes in Individual Mouse Preimplantation Embryos and Blastomeres. Biol Reprod. 80, 194-202
Andreas May, Roland Kirchner, Helena Müller, Petra Hartmann, Nady El Hajj, Achim Tresch, Ulrich Zechner, Wolfgang Mann, Thomas Haaf
