Hochauflösendes Massenspektrometer mit Nano-HPLC-System
Final Report Abstract
Das Gerät wurde seit seiner Inbetriebnahme für eine Vielzahl von Projekten eingesetzt, die im Wesentlichen unter den Oberbegriff der strukturellen Proteomik fallen. In der AG Sinz wird die chemische Quervernetzung in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie genutzt, um Einblicke in die Konformation von Proteinen und Proteinkomplexen zu erhalten. Ziel ist, die Methode systematisch weiterzuentwickeln und zu verbessern, um sie zu einer allgemein anwendbaren Strategie für die Proteinstrukturanalyse zu machen. In den vergangenen Jahren wurde besonderes Augenmerk auf die Entwicklung neuer spaltbarer Quervernetzungsreagenzien und spezieller Software gelegt, um eine automatisierte Auswertung der massenspektrometrischen Daten zu ermöglichen. Auch der Einbau unnatürlicher photoaktivierbarer Aminosäuren, wie die Diazirin-markierten Aminosäureanaloga Photo-Methionin und Photo-Leucin sowie p-Benzoylphenylalanin, für in vivo-Untersuchungen von Proteinkomplexen wurde verbessert und weiterentwickelt. Das Orbitrap Fusion-Massenspektrometer stellt einen zentralen Bestandteil der Forschung der AG Sinz dar, wobei vor allem die mit diesem Gerät verfügbaren Fragmentierungstechniken (CID, HCD, ETD, ETciD, EThcD) essentiell für eine umfassende und automatisierte Analyse der Vernetzungsprodukte in Proteinen sind. Nachfolgend sind die wichtigsten, mit dem Gerät durchgeführten Projekte aufgeführt. Entwicklung neuer MS-spaltbarer Quervernetzungsreagenizen (DFG-Projekt): In diesem Projekt wurden neue Vernetzungsreagenzien entwickelt, synthetisiert und umfassend getestet. Die neuen Reagenzien fragmentieren aufgrund ihrer Struktur bei Kollisionsaktivierung (CID und HCD) in Tandem-MS-Experimenten im Orbitrap Fusion-Massenspektrometer kontrolliert und vorhersehbar und erlauben so eine selektive und hochempfindliche Identifizierung von entsprechend derivatisierten Peptiden. Die neu entwickelten MS-spaltbaren Reagenzien wurden anschließend auf die in der AG bearbeiteten Proteinsysteme angewendet. Studium der Konformationsänderung des Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptor alpha (PPARα) nach Ligandenbindung: PPARs zählen zur Superfamilie der nukleären Rezeptoren. PPARα spielt eine wichtige Rolle im Lipidmetabolismus und stellt ein wichtiges Arzneitstofftarget für das Design neuer lipidsenkender Wirkstoffe dar. Die durch verschiedene niedermolekulare Liganden (Agonisten und Antagonisten) induzierten Konformationsänderungen in PPARα wurden mittels Photoaffinitätsmarkierungsexperimenten und Massenspektrometrie studiert. Hierfür wurde die photoreaktive Aminosäure p-Benzoylphenylalanin (Bpa) wurde an verschiedenen Positionen des PPARα anhand der von Peter Schultz entwickelten Methode gezielt eingebaut. Interaktion zwischen der Photorezeptor-Guanylatcyclase mit deren Bindungsprotein GCAP-2 (DFG-Projekt): Das Guanylatcyclase-aktivierende Protein GCAP-2 reguliert Calcium-abhängig die membranständige Photorezeptor-Guanylatcyclase ROS-GC 1. Störungen in dessen Regulation führen zu degenerativen Retinopathien. Bisher existiert keine Struktur der ROS-GC 1. Chemische Quervernetzung kombiniert mit hochauflösender Massenspektometrie erlaubte es erstmalig, Strukturmodelle des funktionellen Komplexes aus ROS-GC 1 und GCAP-2 sowie des GCAP-2-Homodimers zu erstellen. Laminin-Selbstaggregation und Laminin/Nidogen-Interaktion (BMBF-Projekt ProNet-T3, Teilprojekt T-06): Das heterotrimere, 800 kDa-grosse Glykoprotein Laminin ist der nicht-kollagene Hauptbestandteil der Basalmembranen, der zelluläre Aktivitäten, wie Adhäsion, Migration, Differenzierung und Apoptose kontrolliert. Neben der Untersuchung der Selbstinteraktion von Laminin wurde die Interaktion von Laminin mit Nidogen-1 und -2 studiert. Hier konnten wir Daten aus Quervernetzungsexperimenten (aminreaktive Cross-linker und Einbau von Photo-Methionin) gewinnen, die eine weitere Interaktionsregion zusätzlich zu der mittels Röntgenstrukturanalyse bestätigten Bindungsregion zwischen Laminin und Nidogen-1 vermuten lassen. Studium der Calmodulin/Munc13-Interaktion: Munc13-Proteine besitzen essentielle Funktionen beim Vesikel-Priming und bei der Modulation der synaptischen Stärke. Sie sind somit von entscheidender Bedeutung für die Kurzzeitplastizität (short-term plasticity, STP), einer Anpassungsfähigkeit der Synapsen, je nach Bedarf die passende Anzahl akut freisetzender Vesikel bereitzuhalten. Die Calcium/Calmodulinabhängige Regulation der Splicevarianten bMunc13-2 and Munc13-3 wurde mittels verschiedener heterobifunktioneller photo- und aminreaktiver Quervernetzungsreagenzien sowie nach Einbau von Photo-Methionin in Calmodulin bestätigt und Strukturmodelle zwischen Calmodulin und bMunc13 wurden erstellt. Regulation des Proteintransports und neuroendokrine Sekretion durch den ARF-1 Proteinkinase D-Komplex am Trans Golgi-Netzwerk (DFG-Projekt): Die Serin/Threonin-Proteinkinase D (PKD)-Familie reguliert verschiedene zelluläre Funktionen, wie Proliferation, Invasion und Angiogense. Außerdem sind PKDs für den intrazellulären Proteintransport nötig. Chemische Quervernetzungsexperimente zwischen PKD2 und Zelllysaten aus HEK293-Zellen wurden mittels aminreaktiver Quervernetzungsreagenzien sowie mittels der in PKD eingebauten photo-aktivierbaren Aminosäuren Photo-Met und Photo-Leu durchgeführt. Es konnten mehrere Interaktionspartner der PKD2 identifziert werden, unter anderem der Arp2/3-Komplex mit allen Untereinheiten. Allerdings konnte die postulierte Interaktion zwischen PKD2 und ARF1 nicht bestätigt werden. Struktur-Funktionsstudien zu molekularen Mechanismen der p53-Regulation: Das Protein p53 ist einer der bedeutendsten Tumorsuppressoren, der unter physiologischen Bedingungen als Tetramer vorliegt. Es ist ein DNA-spezifischer Transkriptionsfaktor, der die Expression einer Reihe von spezifischen Zielgenen als Antwort auf genotoxischen Stress reguliert und aktiviert. Ca. 40% der Sequenz von p53 ist intrinsisch ungeordnet, so dass Strukturuntersuchungen mittels Röntgenstrukturanalyse nicht möglich sind. Es gelang uns zum ersten Mal überhaupt, Volllängen Wildtyp-p53 in E. coli zu exprimieren, zu reinigen und daran Strukturuntersuchungen mittels chemischer Quervernetzung/MS und nativer Massenspektrometrie durchzuführen. Die Kombination beider massenspektrometrischer Techniken stellt eine äußerst vielversprechende Methode dar, um intrinsisch ungeordnete Protein zu untersuchen.
Publications
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