NMR Untersuchungen der Aktivitätsmechanismen von DEAD-box Helikasen: ein dynamisches Bild

• Antragstellerin: Professorin Dr. Teresa Carlomagno
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 243403690

Der Kommunikationsmechanismus zwischen den ATP und RNA Bindestellen in DEAD-Box Helikasen ist unbekannt. Dieser Mechanismus ist die Basis der Enzymaktivität und bestimmt wahrscheinlich die Funktion eines DEAD-Box Proteins als Helikase, RNA-Klammer oder RNA-Chaperone. In diesem Projekt wollen wir die dynamische und strukturelle Basis der Aktivität des Bombyx mory DEAD-box Proteins Vasa charakterisieren. Mittels NMR werden wir die Dynamik des wildtyp Proteins und einer Mutante über einen weiten Bereich von Zeitskalen von Pikosekunden bis zu Sekunden untersuchen. Wir werden die Aminosäurereste identifizieren, die für die Kommunikation zwischen den ATP und RNA Bindestellen von Bedeutung sind und diese strukturell und dynamisch charakterisieren. Im Strukturteil der Untersuchung werden wir unseren Fokus auf die Bereiche legen, deren chemische Verschiebung zwischen den verschiedenen Proteinzuständen variiert. Die erhaltenen dynamischen Parameter werden wir in thermodynamische Größen übersetzen, um die Energielandschaft der Vasa Aktivierung auf molekularer Basis zu verstehen. Dazu werden neben den NMR Experimenten kalorimetrische Untersuchungen der Bindung des Nukleotids und der RNA vorgenommen.Wir antizipieren, dass unser Resultat den Mechanismus der Wechselwirkung zwischen den D1 und D2 Domänen von VASA deutlich machen. Das resultierende Funktionsmodell werden wir anhand von in vivo Experimenten in Kollaboration mit der Pillai Gruppe in Grenoble bestätigen. Dazu werden Vasa Mutationen mit modifizierter D1-D2 Dynamik und Thermodynamik entworfen und in BmN4 Zellen untersucht, ob die Fähigkeit den Ping-Pong Mechanismus zur Amplifikation von piRNAs erhalten bleibt. Daraus wird sich ergeben, ob Vasa in Wechselwirkung mit piRNA die Funktion einer RNA Helikase oder/und einer RNA Klammer hat. Dieses Projekt untersucht eine wichtige Klasse von Enzymen, die in fast allen Bereichen des RNA Metabolismus von Bedeutung sind, angefangen von der Transkription, über die Translation bis zum mRNA Abbau. RNA Helikasen sind ubiquitär in Prokaryoten, Archaeen und Eukaryoten und selbst in einigen Viren vorhanden. Mutationen oder Veränderungen der Regulierung von DEAD-Box Helikasen wurden als Ursache verschiedener Erkrankungen, z.B. Krebs, identifiziert. Das Verständnis der Funktionsmechanismen und Substraterkennung dieser Enzymklasse wird die Entwicklung von Medikamenten ermöglichen, die an einer neuen Stelle den Krankheitsverlauf beeinflussen können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen