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Massenspektrometer (LC/MS)

Subject Area Plant Sciences
Term Funded in 2013
Project identifier Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 246242167
 
Final Report Year 2017

Final Report Abstract

Forschungsschwerpunkt des Fachgebietes „Systembiologie der Pflanze“ an der Universität Hohenheim ist die Untersuchung von Regulatorischen Netzwerken bei Anpassungen veränderte Wachstumsbedingungen, insbesondere bei Nährstoffmangel, mit besonderem Fokus auf Membranproteine. Dabei ist hauptsächlich der Modifikationszustand (Phosphorylierung) von Proteinen und deren dynamische Interaktionen innerhalb von Proteinkomplexen von Interesse. Die Nutzung des angeschafften Quadrupole-Orbitrap Massenspektrometer war aufgrund der Sensitivit, Messgenauigkeit und Geschwindigkeit massgeblich beteiligt und wichtig für folgende Forschungsergebnisse, die im Fachgebiet Systembiologie der Pflanze erzielt wurden oder von Kooperationspartnern, die über die Core-Facility Hohenheim (CFH) das Gerät nutzten: 1. Charakterisierung pflanzlicher Signaltransduktionswege ausgehend von Membranrezeptoren. Aufgrund der hohen Proteomabdeckung in markierungsfreien (label-free) quantitativen Analysen konnten neue Phosphorylierungsstellen identifiziert werden, die durch die zucker-induzierte Rezeptorkinase SIRK1 ausgelöst werden. Dabei war Fokus der Analyse vor allem die dynamische Interaktion des Rezeptors SIRK1 mit dem bislang uncharakterisierten Co-Rezeptor SAK1 und deren wechselseitige Phosphorylierung. Weiterhin konnten Calcium-ATPasen, Aquaporine und der Saccharose-Exporter SWEET11 als Substrate des Rezeptor/Corezeptorkomplexes gefunden werden. Viele dieser identifizierten Phosphorylierungsstellen konnten nur aufgrund der hohen Sensitivität des angeschafften Gerätes identifiziert und quantifiziert werden. 2. Identifizierung von frühen Reaktionen auf Nährstoffmangel. In Zusammenarbeit mit dem Fachgebiet Ernährungsphysiologie der Kulturpflanzen (Prof. Dr. Uwe Ludewig) untersuchten wir, wie sich die Abundanz von bestimmten Proteinen in Antwort auf unterschiedliche Nährstoffmangel (N, P, K, Mg, Zn, Fe) verändert. Diese vergleichenden, quantitativen Analysen benötigen hohe und verlässliche Proteomabdeckung in den Analyen, um einen möglichst hohen vergleichend zu quanifizierenden Anteil an Proteinen zu erhalten. Insgesamt konnten über 3000 Proteine über sieben verschiedene Nährstoffbedingungen miteinander verglichen werden. Dabei stellte sich heraus, dass der Mangel an Fe und Zn sehr ähnliche Antworten hervorruft und dass generell die Veränderungen der Proteinabundanzen beobachtet wurden, bevor es zu Genexpressionsänderungen kam. Bekannte Veränderugen an Protonen-ATPase und diversen Nährstofftransportern konnten bestätigt werden. 3. Untersuchung von sekretierten Proteinen im Verdauungssaft der Venus-Fliegenfalle. Venusfligenfalle (Dionaea muscipula) ist eine Pflanze mit zu einer durch mechanische Reize auslösbare Falle modifizierten Blättern, in denen Insekten gefangen und verdaut werden. Dabei schließt sich die Falle dicht ab und es werden Verdauungsenzyme sekretiert, die die Beutetiere zersetzen. Die im Verdauungsprozess frei werdenden Nährstoffe werden dann durch an der Fallenoberfläche lokalisierten Transportern aufgenommen. Wir leisteten in Zusammenarbeit mit Prof. Rainer Hedrich (Universität Würzburg) einen ersten Beitrag, diese sekretierten Proteine zu charakterisieren und das zugehörige endokrine Regulationsnetzwerk aufzuklären. Diese Arbeiten erforderten ebenfalls ein besonders sensitives Massenspektrometer um hohe Abdeckung an identifizierten Proteinen zu erreichen. Ebenfalls besonders wichtig war die hohe Massengenauigkeit, da die Sequenzen der Dionaea-Proteasen sehr ähnliche tryptische Peptide enthalten und nur mit hoher Massengenauigkeit so eine eindeutige Identifizierung ermöglicht wurde. 4. Identifizierung von Spaltstellen und Zielproteinen pflanzlicher Proteasen. In Zusammenarbeit mit dem Fachgebiet „Physiologie und Biotechnologie der Pflanze“ (Prof. Dr. Andreas Schaller) konnte die Nutzung des angeschafften Gerätes entscheidend zur Aufklärung des Peptidsignalweges ausgelöst durch das Hormonpeptid IDA beitragen. In Pflanzen gibt es kleine, sekretierte Peptide, die bei Bindung an extrazelluläre Domänen von Rezeptorkinasen bestimmte Signalantworten auslösen. So löst zb. das Signalpeptid IDA nach Bindung an den Rezeptor HASEA die Abszission von Blütenorganen aus. Die Signalpeptide reifen in der Regel durch proteolytische Spaltung eines Vorläuferproteins. Bislang war unbekannt, welche Protease für die Spaltung des IDA-Vorläufers verantwortlich ist. In unseren Arbeiten konnten wir zwei Proteasen der Subtilasefamilie als für die IDA- Reifung verantwortlich charakterisieren. Das angeschaffte Quadrupole-Exactive Massenspektrometer wurde hier eingesetzt, um hochpräzise aus Peptidgemischen ein Spezifitätsprofil der zwei Protease zu erstellen, und in gerichteten Analysen die Spaltung diverser IDA-Vorläufer zu analysieren. 5. Metaproteomanalysen zur Charakterisierung von Mikrobiota im Verdauungstrakt von Wiederkäuern. Die von Prof. Dr. Seifert besetzte Juniorprofessur ‚Feed-Gut Microbiota Interaction’ beschäftigt sich mit den mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Verdauungstrakt von Nutztieren. Insbesondere wird der Einfluss von unterschiedlichen Futterarten und deren Auswirkung auf das Mikrobiom im Verdauungstrakt untersucht. Zur Aufklärung dieser Fragestellungen, die besonders komplexe metaproteomische Daten generiert, ist ein hochauflösender Massenspektrometer essenziell. In langen Gradienten mit reproduzierbarer Chromatographie wurden mit Hilfe des angeschafften Gerätes wurden ein erster Einblick gewonnen in die mikrobielle Zusammensetzung verschiedener Regionen im Verdauungstrakt vom Schwein.

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