Funktionale Charakterisierung eines neuen, mittels Exomsequenzierung identifizierten Kandidatengens für hereditäre zerebrale kavernöse Gefäßfehlbildungen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Gibt es ein viertes Gen, CCM4, in dem pathogene Varianten autosomal-dominant vererbte zerebrale kavernöse Malformationen (CCM) verursachen? In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der internationalen Angioma Alliance, die 2017 erstmals eine Synopsis von Empfehlungen für das klinische Management von Kavernomen publizierte, kann festgestellt werden: Vermutlich nicht. Im Laufe des Förderzeitraums stellte sich heraus, dass die sehr hohe Mutationsdetektionsrate für familiäre CCMs von ca. 90% auf nahezu 100% gesteigert werden kann, wenn strikte Einschlusskriterien eingehalten und routinemäßige Genpanelanalysen der Gene CCM1-3 im Einzelfall durch Whole Genome Sequencing (WGS) ergänzt werden. In Kombination mit einer guten bioinformatischen Datenauswertung ermöglichte WGS es, eine 24 kB große Inversion, welche das Exon 1 des CCM2-Gens enthält, in einer Familie aufzudecken, die im Rahmen der Standarddiagnostik, der PCR-basierten Analyse der gesamten genomischen CCM1-3 Regionen sowie von Exomsequenzierungen mutationsnegativ geblieben war. Die Mutationsdetektionsrate für Patienten mit negativer Familienanamnese liegt u.a. wegen der Möglichkeit postzygotischer Mutationsereignisse bei etwa 60-75% und ist stark abhängig von den Einschlusskriterien für die molekulargenetische Analyse, die von der Angioma Alliance 2017 strenger formuliert wurden. Das vorliegende Projekt zielte schwerpunktmäßig auf die funktionale Charakterisierung von FAM222B als möglichem Kandidatengen für zerebrale kavernöse Malformationen ab, welches zunächst durch Exomsequenzierungen identifiziert und später durch Genomsequenzierungen grundsätzlich bestätigt worden war. Struktur und Funktion des Genprodukts waren zu Projektbeginn unbekannt. Durch eine Yeast-two-Hybrid-Analyse wurden mit TUBB, TUBB2A, TUBB2B und TUBA1B sowie STAMBP Interaktionspartner identifiziert, die für die Endothelzellmorphologie und -permeabilität Relevanz haben können. Ferner konnte durch die Morpholino-basierte Herunterregulation von fam222b im Zebrafischmodellsystem initial ein verändertes Erscheinungsbild der Gefäße in Zebrafischembryonen beobachtet werden, welches dem ccm1- und ccm2-mutanter Zebrafischembryonen ähnelte. Die gezielte Mutagenese von fam222bb und dem erst im Projektverlauf bekannt gewordenen Duplikat fam222ba mittels der zu Projektbeginn hochaktuellen TALEN-Technik führte in Zebrafischembryonen hingegen nicht zu einer veränderten vaskulären Morphologie. Auch in vitro zeigte die siRNA-vermittelte, vorübergehende Herunterregulation von FAM222B keine biologischen Effekte auf das Sprossungsverhalten von humanen Nabelschnurvenenendothelzellen. Die Tatsache, dass die bei einer bereits im Alter von fünf Jahren operierten Patientin im FAM222B-Gen identifizierte 2-Basenpaardeletion 2016 drei Mal in der ExAC-Datenbank gelistet war und inzwischen im gnomAD-Browser mit 14 weiteren trunkierenden FAM222B-Mutationen sogar acht Mal beschrieben ist, unterstützt die Beurteilung, dass es sich bei FAM222B nicht um CCM4 handelt. Somit wird die im Projektverlauf in humanen Endothelzellkulturen erfolgreich etablierte CRISPR/Cas9-Genomeditierung nun zur Erforschung pathogenetischer Mechanismen und individualisierter Therapieansätze für Träger pathogener Varianten in den CCM1-3 Genen genutzt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2016). FAM222B is not a likely novel candidate gene for cerebral cavernous malformations. Mol. Syndromol. 7:144-152
Spiegler S, Kirchmaier B, Rath M, Korenke GC, Tetzlaff F, van de Vorst M, Neveling K, Acker- Palmer A, Kuss AW, Gilissen C, Fischer A, Schulte-Merker S, Felbor U
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(2016): Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Kandidatengens für kavernöse Gefäßmalformationen des zentralen Nervensystems
Stefanie Spiegler
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(2017). Constitutional de novo and postzygotic mutations in isolated cases of cerebral cavernous malformations. Mol. Genet. Genomic Med. 5:21-27
Rath M, Spiegler S, Nath N, Schwefel K, Di Donato N, Gerber J, Korenke GC, Hellenbroich Y, Hehr U, Gross S, Sure U, Zoll B, Gilberg E, Kaderali L, Felbor U
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(2017): Keine molekulargenetische Evidenz für eine Assoziation von FAM222B mit zerebralen kavernösen Malformationen
Christin Paperlein
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(2018). Cerebral cavernous malformations (CCM): An Update on Prevalence, Molecular Genetic Analyses and Genetic Counselling. Mol. Syndromol. 2018;9:60-69
Spiegler S, Rath M, Paperlein C, Felbor U
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(2018). First large genomic inversion in familial cerebral cavernous malformation identified by whole genome sequencing. Neurogenetics 19:55-59
Spiegler S, Rath M, Hoffjan S, Dammann P, Sure U, Pagenstecher A, Strom T, Felbor U
