Konfokales Laser Scanning-Mikroskop mit gepulster 1- und 2-Photonenanregung
Final Report Abstract
Das beantragte und installierte Mikroskop dient als Basis für die Weiterentwicklung von Techniken zur quantitativen, multidimensionalen Fluoreszenzmessung in mikroskopischen Präparaten. Das Mikroskop ist hierzu mit einem Weißlichtlaser zur gepulsten 1-Photonen- und einem TiSa-Laser zur gepulsten 2-Photonen- Anregung ausgestattet. Vier Hybrid-Detektoren erlauben derzeit die zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung in vier frei konfigurierbaren spektralen Kanälen. Parallel zu den optischen Messungen können elektrophysiologische Messungen durchgeführt und simultan aufgezeichnet werden. In einer zweiten (noch nicht realisierten) Phase des Projektes soll das System mit PMT-Arrays so erweitert werden, dass eine Erfassung aller relevanten Fluoreszenzparameter (Intensität, Fluoreszenzlebensdauer, Anisotropie, spektrale Verteilung) in 2 x 16 parallelen Kanälen erfolgt, die dann zusammen mit den elektrophysiologischen Daten einer globalen Analyse zugeführt werden können. Mehrere Forschungsprojekte der Arbeitsgruppe haben die Aufklärung von Protein-Protein- und Protein- DNA-Interaktionen zum Ziel. Zum Nachweis der Interaktion sollen Förster-Resonanz-Energietransfer- (FRET) Messungen in lebenden Zellen eingesetzt werden. FRET tritt dann auf, wenn sich ein Donor- Fluorophor in räumlicher Nähe (< 10 nm) zu einem geeigneten Akzeptormolekül befindet. Der Donor kann in diesem Fall seine Anregungsenergie auf den Akzeptor übertragen, der dann seinerseits Fluoreszenzlicht emittieren kann. Dabei nehmen die Fluoreszenzintensität und die Fluoreszenzlebensdauer des Donors ab, während die Fluoreszenzintensität des Akzeptors zunimmt. Über die Messung eines oder mehrerer dieser Parameter kann eine Bestimmung der FRET-Effizienz und damit der Nachweis der Protein-Protein- Interaktion erfolgen. Erste Schritte im Projekt befassten sich mit der Validierung der vom Hersteller implementierten Methoden zur Bestimmung von FRET (AB-FRET, SE-FRET, FLIM-FRET). Die Kontrollmessungen zeigten, dass die vom Hersteller gelieferten Lösungen wenig bzw. überhaupt nicht brauchbar sind. Die Software für intensitätsbasierte FRET Messungen ist nicht nur in der Handhabung umständlich, sondern liefert auch falsche Ergebnisse. Erschwert wird die Auswertung der Daten zusätzlich dadurch, dass die Intensität der eingekoppelten Laser über die Zeit stark schwankt. Verlässliche intensitätsbasierte FRET-Messungen sind damit nicht möglich, wenn die Referenzmessungen nicht zeitnah durchgeführt werden. Auch Fluoreszenzlebensdauermessungen des vom Hersteller installierten Systems erreichen nicht die Präzision, die die Arbeitsgruppe bereits mit anderen Systemen erreicht hat. Ein wesentlicher Teil der Arbeit wurde deswegen in der ersten Projektphase auf die Identifizierung von Fehlerquellen, die Erarbeitung von technischen Lösungen und die Programmierung eigener Softwareroutinen zur Auswertung der Daten verwandt. Bislang wurde das Mikroskop in den folgenden Projekten eingesetzt: 1.) Charakterisierung verschiedener Varianten des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) für ihre Eignung in fluoreszenzintensitäts- und fluoreszenzlebensdauer basierten FRET- Messungen. 2.) Charakterisierung von Faktoren, die an der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) durch homologen Rekombination (HR) beteiligt sind: Die eingeschränkte Reparatur von DNA- Doppelstrangbrüchen ist häufig assoziiert mit unterschiedlichen biologischen Störungen und ist eine Hauptursache für Krebserkrankungen. Das konfokale Laser Scanning Mikroskop dient in diesem Teilprojekt der Charakterisierung von Faktoren, die an der Reparatur von DSBs mittels HR beteiligt sind. In FRAP-Experimenten (unter live-cell imaging Bedingungen) entdeckten wir eine reduzierte Mobilität von nuklearen RAD51 im Vergleich zur cytosolischen RAD51-Subfraktion nach Auftreten von DSBs, die vermutlich auf Assemblierung in Reparaturfoci zurückzuführen ist. Mittels Fluoreszenzlebensdauermessungen wird derzeit die Interaktion der DNA-Reparaturenzyme untersucht. 3.) Analyse der Ras-Aktivierung in lebenden Zellen (Kooperationsprojekt mit I. Rubio, Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin, Universitätsklinikum Jena): Mit YFP markiertes Ras und mit BODIPY-TR markiertes GTP wurde genutzt, um die Ras und GTP-Verteilung in HeLa Zellen vor und nach Aktivierung des EGF-Rezeptors zu untersuchen. Über die Messung der FRET Effizienz zwischen Ras-EYFP und GTP-BODIPY-TR konnte die Bindung von GTP an Ras und damit die Aktivierung von Ras verfolgt werden. 4.) Untersuchung der Assemblierung, der Ligandenbindung und des Schaltens heterotetramerer CNG- Kanäle über FRET-Messungen (Kooperation im Rahmen des SFB/TR 166 mit V. Nache, Institut für Physiologie II, Universitätsklinikum Jena): Durch cyclische Nukleotide gesteuerte Kanäle (CNG-Kanäle) stellen den letzten Schritt in der Signaltransduktionskaskade von Photorezeptoren dar. In diesem Projekt werden mit Hilfe optischer und elektrophysiologischer Techniken die elementaren Schritte, wie die Bindung der Liganden an die jeweiligen Untereinheiten und die nachfolgenden Konformationsänderungen untersucht. Ein zweiter Teil des Projektes zielt auf die Untersuchung der Mechanismen ab, die die feste Stöchiometrie der Untereinheiten gewährleisten, aus denen sich die tetrameren Kanäle zusammensetzen. Über FRET-Messungen wird analysiert, wann und wo die Untereinheiten assoziieren. 5.) Spektrale Analyse von autofluoreszenten Ablagerungen in Purkinje Zellen bei hereditären spastischen Paraplegien (Kooperation mit C. Hübner, Institut für Humangenetik, Universitätsklinikum Jena): Hereditäre spastische Paraplegien (HSP) sind eine genetisch heterogene Gruppe von Erkrankungen, die sich klinisch in einer progressiven Spastik und Schwäche der Beine als Hauptsymptom manifestieren. In einem Mausmodell wurde die SPG48-Form generiert und die Entstehung autofluoreszenter Abbauprodukte in neuronalen Zellen untersucht. 6.) Datenmanagement (Kooperation im Rahmen des SFB/TR 166 mit M. Bücker und B. König-Ries, Institut für Informatik, FSU Jena): Kontrollmessungen mit kommerziell erhältlicher bzw. mit der mit dem Mikroskop gelieferten Software zeigen, wie offensichtliche Software- und Hardwarefehler das Ergebnis einer Messreihe beeinflussen können. Um eine Fehlinterpretation der Daten zu verhindern, eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten und, falls nötig, eine Korrektur einer fehlerhaften Auswertung zu ermöglichen, ist es wichtig neben den Messdaten, die Vorbereitung der Proben und die Analyse der Daten zu dokumentieren. Im Rahmen der Kooperation werden Lösungen zur Organisation und systematischen Analyse der Daten entwickelt.
Publications
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Imaging cytochrome C oxidase and FoF1-ATP synthase in mitochondrial cristae of living human cells by FLIM and superresolution microscopy. SPIE Proceedings, 10071, 100710P. SPIE.
Foertsch, Franziska; Ilchenko, Mykhailo; Heitkamp, Thomas; Noßmann, Silke; Hoffmann, Birgit; Starke, Ilka; Mrowka, Ralf; Biskup, Christoph & Börsch, Michael
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A mouse model for SPG48 reveals a block of autophagic flux upon disruption of adaptor protein complex five. Neurobiology of Disease, 127, 419-431.
Khundadze, Mukhran; Ribaudo, Federico; Hussain, Adeela; Rosentreter, Jan; Nietzsche, Sandor; Thelen, Melanie; Winter, Dominic; Hoffmann, Birgit; Afzal, Muhammad Awais; Hermann, Tanja; de Heus, Cecilia; Piskor, Eva-Maria; Kosan, Christian; Franzka, Patricia; von Kleist, Lisa; Stauber, Tobias; Klumperman, Judith; Damme, Markus; Proikas-Cezanne, Tassula & Hübner, Christian A.
