Hochmodulares RESOLFT-Mikroskop
Final Report Abstract
Bei dem Gerät handelt es sich um ein hochmodulares RESOLFT-Mikroskopiesystem, das an veränderte experimentelle Bedingungen hochgradig anpassbar ist. Das Mikroskop erlaubt das Abbilden von verschiedenen schaltbaren fluoreszierenden Proteinen in lebenden Zellen mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze (< 50 nm) bei 103 bis 106-fach geringeren Lichtleistungen, als bei allen anderen bekannten diffraktions-unbegrenzten super-resolution Mikroskopieverfahren (Nanoskopie). Dank dieser niedrigen Lichtstärken ist die RESOLFT Nanoskopie prädestiniert für die Abbildung lebender Zellen. In den ersten drei Jahren der Nutzung wurde das Mikroskop eingesetzt, um verschiedene reversibel schaltbare fluoreszierende Proteine zu charakterisieren und ihre Nutzbarkeit für die RESOLFT Nanoskopie zu bestimmen. Unter anderem wurden die RSFPs rsEGFP, rsEGFP2, rsFolder und rsGreen für die RESOLFT Nanoskopie unter Einsatz des Geräts evaluiert und erfolgreich genutzt. In der Vergangenheit war die RESOLFT Nanoskopie auf die Nutzung von lebenden Zellen beschränkt, da eine chemische Fixierung der Zellen unweigerlich zu einer Veränderung der Schalteigenschaften der RSFPs führt. In einer Studie haben wir die die Antikörperbindedomäne von Protein A mit einer Tandemkonstruktion von rsEGFP2 fusioniert, in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Dieses Protein wurde analog zu sekundären Antikörpern verwendet und ermöglichte die Verwendung von chemisch fixierten und mit primären Antikörpern dekorierten Zellen in der RESOLFT Nanoskopie. Alle bisherigen RESOLFT Techniken basierten auf der Nutzung von reversibel schaltbaren Fluoreszenzproteinen, die ihr Fluoreszenzlicht im grünen Bereich des Spektrums emittieren. Für die Untersuchung von intakten, lebenden Geweben oder ganzer Organismen ist allerdings eine Verlagerung des Emissionsspektrums der Fluoreszenzproteine in den roten Bereich wünschenswert. Aufgrund der hohen Modularität des RESOLFT Nanoskops war es möglich, das Mikroskop um die Detektion roter Fluoreszenzproteine zu erweitern. In Verbindung mit dem neuen schaltbaren, roten Fluoreszenzprotein rsCherryRev1.4, ko-exprimiert mit dem grünen Fluoreszenzprotein Dronpa-M159T, gelang es, zwei-Farben RESOLFT Nanoskopie zu etablieren. Die Einschleusung von Fluoreszenzproteinen in tierische Zellen wird in der Regel durch die Transfektion dieser Zellen mit Expressionsplasmiden erreicht. Dies kann jedoch zu Überexpressionsartefakten wie Fehlfaltungen von Fusionsproteinen, Fehllokalisierungen der Proteine innerhalb der Zelle und zu anderen unerwünschten Auswirkungen führen. Mit Hilfe der CRISPR/Cas9 Technologie gelang es, verschiedene humane heterozygote und homozygote „knockin“ Zelllinien zu erzeugen, die Fusionsproteine mit dem RSFP rsEGFP2 exprimieren. Das RESOLFT Nanoskop wurde genutzt, um die nanoskaligen Verteilungen der Fusionsproteine zu untersuchen. Das RESOLFT Mikroskop wurde auch genutzt, um zum ersten Mal lebende intakte Fliegenlarven von Drosophila melanogaster hochauflösend zu untersuchen.
Publications
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