MALDI-/ESI-IMS-QqTOF-Massenspektrometer
Final Report Abstract
Die Wirksamkeit der in einer der beteiligten Arbeitsgruppe entwickelten antibakteriell wirksamen Peptidklassen der Apidaecine und Oncocine konnte in vier verschiedenen Mausmodellen belegt werden. Zur Optimierung der Peptidwirkstoffe und zur Aufklärung des Wirkmechanismus wurden im Berichtszeitraum die bakteriellen Zielproteine (Targets) über eine kovalente Photocrosslink- Strategie in lebenden Escherichia coli Zellen markiert, isoliert und an dem geförderten Massenspektrometer identifiziert und relativ quantifiziert. Dabei wurden fast 100 Proteine identifiziert, die unterschiedlichen Proteinkomplexen als Bindungspartner zugeordnet werden konnten. Über die identifizierten ribosomalen Proteine konnten wir das bakterielle 70S Ribosom als wichtigstes letales Target identifizieren. Daneben wurden auch die Chaperone DnaK und GroEL als mögliche Targets nachgewiesen. Weitere Studien der Gruppe bestätigten das Ribosom als letales Target und identifizierten die Bindungsstellen, was von anderen Arbeitsgruppen mittels Röntgenstrukturanalysen für Apidaecine und Oncocine später unabhängig bestätigt wurde. In einer Pharmakokinetik-Studie (intravenöse und intraperitoneale Injektion der Wirkstoffe) konnten am Massenspektrometer die Abbauprodukte der Peptide in Blut identifiziert werden (Metabolisierung). Die Synthese und Reinheit weiterer, neu entwickelter und optimierter Peptidwirkstoffe konnten mit der MALDI-Quelle bestätigt werden, wobei auch Nebenprodukte strukturell aufgeklärt wurden. Ferner wurden am MALDI-/ESI-IMS-QqTOF-Massenspektrometer die Regulationsmechanismen des nicht-photochemischen Quenching der Chlorophyll-Fluoreszenz (NPQ), einem der wichtigsten Photoprotektionsmechanismen der Pflanzen und Algen, untersucht. In Kieselalgen (Diatomeen) ist dafür eine Umstrukturierung der Antennenkomplexe (FCPs) des Photosystems II verantwortlich, die bei hohen Lichtintensitäten dazu führt, dass die überschüssige Anregungsenergie als harmlose Wärme abgegeben wird. Die Arbeiten zeigen, dass die Aggregation der Antennenkomplexe auf der enzymatischen Umwandlung des Carotinoids Diadinoxanthin zu Diatoxanthin, sowie der Protonierung bestimmter Aminosäureseitenketten der Antennenproteine, beruht. Ferner konnte gezeigt werden, dass das Antennenprotein Lhcx1 anwesend sein muss um die Aggregation zu unterstützen. Sowohl in Organismen als auch in Lebensmitteln laufen Maillard-Reaktionen ab, die initial N- glykierte Proteine und Lipide generieren, aus denen über weitere Reaktionen AGEs (advanced glycation endproducts) entstehen können. Mittels LC-ESI-IMS-MS/MS konnten wir diese AGE- Modifikationen in verschiedenen Milchprodukten identifizieren und die Strukturen der jeweiligen AGEs auch aufklären. Dabei war neben der Trennung mittels Ionenmobilitätsspektrometrie auch die Fähigkeit zur Aufnahme von MSE-Spektren wichtig, d.h. die datenunabhängig (data independent acquisition, DIA), die insbesondere für komplexe Probengemische vorteilhaft ist. An dem Massenspektrometer wurden zudem unterschiedliche Lipidklassen in Cardiomyozyten, die milden nitroxidativen Stressbedingungen ausgesetzt wurden, identifiziert und für unterschiedlich behandelte Zellkulturen relativ quantifiziert. Die Identifizierung der teils unbekannten Lipidmodifikationen basierte auf der hohen Massengenauigkeit im gesamten Massenbereich der Tandemmassenspektren, was das vorhandene MS (Ionenfalle) nicht ermöglichte. Mit der selbst entwickelten Software LipidHunter konnte die Gruppe insgesamt 202 Lipide aus 6 unterschiedlichen Phospholipidklassen strukturell aufklären. Davon variierten die Mengen von 93 Lipidspezies unter Stressbedingungen in den Zellen. Eine große analytische Herausforderung stellten die vielen Isomere der oxidierten Lipide dar, die jedoch nach eingehender Optimierung der massenspektrometrischen Parameter strukturell aufgeklärt und zuverlässig unterschieden werden konnten. Die Cysteinreste von Proteinen unterliegen in Zellen unterschiedlichen Oxidationsvorgängen, wobei viele Oxidationen reversibel sind. Unter oxidativen Stressbedingungen nimmt der Anteil der oxidativen Spezies zu, wobei auch vermehrt irreversible Oxidationsprodukte auftreten. Die unterschiedlichen Cystein-Oxidationsprodukte wurden selektiv reduziert und derivatisiert, so dass sie danach mittels RPC-nanoESI-MS/MS identifiziert und für verschiedene Zellzustände relativ quantifiziert werden konnten, z.B. Sulfensäuren in 53 Proteinen und nitrosylierte Reste in 266 Proteinen. Bei Entzündungskrankheiten (z.B. Rheumatoider Arthritis) können lokal hohe Konzentrationen an hypochloriger Säure (HOCl) auftreten. Dieses starke Oxidationsmittel kann unter anderem Lipide angreifen. Mit dem bewilligten Massenspektrometer konnte gezeigt werden, dass die Chlorhydrine von Fettsäuren zumindest in vitro auch dimerisieren und trimerisieren können.
Publications
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(2015) Short Proline-Rich Antimicrobial Peptides Inhibit Either the Bacterial 70S Ribosome or the Assembly of its Large 50S Subunit. ChemBioChem 16 (16): 2304-8
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(2015) The diadinoxanthin diatoxanthin cycle induces structural rearrangements of the isolated FCP antenna complexes of the pennate diatom Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiol. Biochem. 96: 364-376
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