Allosterische Kommunikation und Untereinheiten-Spezifität in Glutaminamidotransferasen
Strukturbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Wir haben funktionelle Interaktionen zwischen den Synthase- und den Glutaminase-Untereinheiten von Glutaminamidotranferasen (GATasen) und die strukturellen Grundlagen dieser Wechselwirkungen untersucht. Im ersten Arbeitspaket, wurden Steady-state Enzymkinetik, multi-dimensionale NMR-Spektroskopie und Röntgenkristallographie verwendet, um den allosterischen Signalweg zwischen der Synthase (Cyclase) Untereinheit HisF und der Glutaminase Untereinheit HisH der Imidazolglycerinphosphatsynthase (ImGP-S) zu entschlüsseln. Die Ergebnisse zeigten, dass die gleichzeitige Bindung des HisF-Substrates N’-[(5’-phosphoribulosyl)-formimino]-5-aminoimidazole-4-carboxamidribonucleotid (PRFAR) and des HisH- Substrates Glutamine (Gln) erforderlich sind, um die inaktive Form der ImGP-S in die aktive Form des Enzyms zu überführen. Dieser Übergang geht einher mit einer Konformationsänderung von Loop1 in HisF, Umlagerungen im Inneren von HisF, der Abschottung der Cyclase:Glutaminase Kontaktfläche vom Lösungsmittel, sowie der Ausbildung der Oxyanionentasche am aktiven Zentrum von HisH. Zusätzlich haben wir mittels Röntgenstrukturanalyse und gerichteter Mutagenese aufgeklärt, wie die Glutaminase PabA durch die Synthase PabB im 4- Amino-4-deoxychorismate synthase (ADC-S) Komplex stimuliert wird. Dabei haben wir gefunden, dass die Inkubation mit Glutamin zu einer etwa 30%igen Ausdehnung der Synthase:Glutaminase Kontaktfläche führt, welche die Abschottung des aktiven Zentrums von PabA vom Lösungsmittel zur Folge hat und den anschließenden Transport des gebildeten Ammoniak zum aktiven Zentrum von PabB ermöglicht. Im zweiten Arbeitspaket haben wir mittels Proteinengineering die Evolution des orthogonalen TrpEx:TrpG (anthranilate synthase, AS) / PabB:PabA (ADC-S) Systems, das in “modernen” γ-Proteobacterien vorkommt, aus dem TrpE:PabA (Anthranilat Synthase) / PabB:PabA (ADC-S) System, das in ursprünglicheren Bakterien gefunden wird, nachvollzogen. Zu diesem Zweck wurden über zwei unterschiedliche Ansätze TrpG-spezifische Aminosäuren in PabA eingebaut, einmal durch Kontaktflächendesign basierend auf der Software Rosetta und einmal durch einen Daten-basierten Ansatz, dem die differentielle Konservierung von Resten in TrpG und PabA zugrunde lag. Gelfiltrationschromatographie und Aktivitätstitrationen zeigten, dass beide Ansätze in PabA Varianten resultierten, die TrpEx mit höherer Affinität als den nativen Interaktionspartner PabB binden. Die damit erreichte Umprogrammierung einer Protein-Protein Interaktionsspezifiät erlaubt neuartige Einblicke in die evolutionäre Anpassung von Protein-Kontaktflächen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
-
Significance of the Protein Interface Configuration for Allostery in Imidazole Glycerol Phosphate Synthase. Biochemistry, 59(29), 2729-2742.
Kneuttinger, Andrea C.; Rajendran, Chitra; Simeth, Nadja A.; Bruckmann, Astrid; König, Burkhard & Sterner, Reinhard
-
Molecular basis for the allosteric activation mechanism of the heterodimeric imidazole glycerol phosphate synthase complex. Nature Communications, 12(1).
Wurm, Jan Philip; Sung, Sihyun; Kneuttinger, Andrea Christa; Hupfeld, Enrico; Sterner, Reinhard; Wilmanns, Matthias & Sprangers, Remco
-
Reprogramming the Specificity of a Protein Interface by Computational and Data-Driven Design. Structure, 29(3), 292-304.e3.
Hertle, Regina; Nazet, Julian; Semmelmann, Florian; Schlee, Sandra; Funke, Franziska; Merkl, Rainer & Sterner, Reinhard
-
Mechanistic analysis and antibiotic target validation of aminodeoxychorismate synthase and anthranilate synthase. Doctoral thesis, University of Regensburg.
Funke, Franziska
