Mechanismus und Regulation der RNA-Entwindung durch DEAD-Box RNA-Helikasen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Dagmar Klostermeier
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 250786717

RNA-Helikasen katalysieren die ATP-abhängige Entwindung doppelsträngiger RNA in nahezu allen Prozessen des RNA-Metabolismus. DEAD-Box-Helikasen bestehen aus einem konservierten Helikase-Modul, das in einen nukleotidgesteuerten Konformationszyklus eine basale Entwindungsaktivität vermittelt. Die Nukleotidbindung und –hydrolyse, RNA-Bindung und -Entwindung durch das Helikase-Moduls kann durch flankierende Regionen, durch andere Untereinheiten in Oligomeren und durch Interaktionspartner reguliert werden. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind bisher wenig verstanden. Im vorgeschlagenen Projekt werden wir die Regulation des Helikase-Mechanismus durch flankierende Regionen, andere Untereinheiten sowie Interaktionspartner untersuchen. Aufbauend auf unseren Ergebnissen der vorherigen Förderungsperiode werden wir den Mechanismus der allosterischen Aktivierung des Helikase-Moduls durch RNA-Bindung an RNA-Bindungsdomänen (RBDs) aufklären. Hierzu werden wir repräsentativ die spezifische RNA-Helikase YxiN aus B. subtilis und die unspezifische Helikase Hera aus T. thermophilus untersuchen, die beide eine C-terminale RBD aufweisen. Mittels ortsspezifischer Mutagenese, ATPase- und RNA-Entwindungsassays sowie Einzelmolekül-FRET werden wir die Signalweiterleitung von der RBD zum Helikase-Modul entschlüsseln, die Aktivierung in YxiN und möglicherweise in Hera vermittelt. Weiterhin werden wie die in vivo Funktion von Hera und den Mechanismus der Entwindung durch das Hera-Dimer untersuchen. Hierzu haben wir mittels eCLIP-seq physiologische RNA-Bindungspartner von Hera in Thermus identifiziert. Hera ist die einzige dimere DEAD-Box-Helikase. Wir werden die funktionelle Kooperation der beiden Helikase-Module im Hera-Dimer während der RNA-Entwindung mittels Einzelmolekül-FRET untersuchen. Hierzu werden wir ein minimales RNA-Substrat verwenden, um die thermodynamischen und kinetischen Grundlagen der RNA-Bindung und -Entwindung zu entschlüsseln, sowie ein physiologisches Substrat, das beide Helikase-Module des Dimers kontaktiert. Um die Mechanismen der eIF4A-Regulation während der Initiation der Translation aufzuklären, werden wir den Einfluss anderer Translationsinitiationsfaktoren im Kontext der Translationsinitiation untersuchen. Wir werden 5‘-UTRs von mRNAs verwenden, deren Translation eine starke Anhängigkeit von eIF4A zeigt, und deren Effekt auf die Kinetik der eIF4A-Konformationsänderungen mittels Einzelmolekül-FRET-TIRF-Mikroskopie bestimmen. Hierzu haben wir ein in vitro Translationssystem etabliert, das uns erlaubt, die Translationseffizienz mit der konformationellen Dynamik von eIF4A und seiner Helikaseaktivität zu korrelieren.Insgesamt werden diese Arbeiten die Prinzipien der Regulation von Helikase-Modulen durch flankierende Regionen, Dimerisierung und durch Wechselwirkungspartner entschlüsseln und aufzeigen, wie diese funktionelle Einheit auf diese Weise optimal auf ihre zelluläre Funktion zugeschnitten werden kann.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen