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LC-MS/MS für die Proteomanalytik

Subject Area Basic Research in Biology and Medicine
Term Funded in 2013
Project identifier Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 251253742
 
Final Report Year 2017

Final Report Abstract

Proteine sind wichtige molekulare Akteure in lebenden Systemen, da sie praktisch alle molekularen Vorgänge in Zellen steuern. Die Zahl z. B. menschlicher Proteine (das Proteom) ist enorm hoch. Aus den ca. 20.000 Genen des Menschen lassen sich gut 100.000 verschieden Proteine ableiten, die ihrerseits jeweils in vielfältiger Weise abgewandelt werden können und dadurch zu einer erstaunlichen molekularen Vielfalt führen, die für die große Zahl von Proteinfunktionen in allen Lebensformen notwendig ist. Die HPLC-gekoppelte Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) ist die derzeit wichtigste analytische Basistechnologie in der Proteomforschung da sie es erlaubt, tausende Proteine sowohl qualitativ als auch quantitativ in einem Experiment zu erfassen und somit z. B. die Veränderungen der Zusammensetzung von Proteomen in unterschiedlichsten physiologischen oder pathologischen Situationen zu analysieren. Die konkreten Aufgaben des geförderten LC-MS/MS Systems bestanden in der Hauptsache in: a) der Messung von komplexen aus enzymatischem Verdau von Geweben oder Zellkulturen gewonnenen Peptidgemischen zur Identifikation der in diesen Geweben oder Zellkulturen vorhanden Proteine. Hierbei wurde neben der chromatographischen Trennung der Peptide, die Elektrospray-Ionisierung sowie die stoßinduzierte Fragmentierung der Peptide im Gerät eingesetzt. Aus den erhaltenen Fragmentionenspektren lässt sich über computergestützte Verfahren auf die Aminosäuresequenz des Peptids und somit auf die Identität des Proteins rückschließen. b) der Quantifizierung von Proteinen aus ebendiesen komplexen Mischungen. Hierbei bedient man sich der Tatsache, dass das MS Signal eines Peptids ein relatives Maß für seine Menge ist. Hierzu wurden sowohl Methoden der Stabilisotopenmarkierung, als auch sogenannte markierungsfreie Verfahren angewandt. c) der Analyse von post-translationalen Proteinmodifikationen. Proteine werden in Zellen auch nach ihrer Synthese vielfältig molekular abgewandelt, was oftmals von entscheidender Bedeutung für die Funktion der Proteine ist. Mit diesen Modifikationen gehen zumeist Veränderungen der Masse des Proteins einher, weshalb sich die Massenspektrometrie besonders für diese Anwendung eignet. Konkret wurde mit dem geförderten Gerät die Modifizierung von Proteinen durch Phosphorylierung untersucht. Das LC-MS/MS System über das hier konkret berichtet wird, wurde und wird in einer Vielzahl von grundlegenden sowie angewandten Forschungsprojekten in den Lebenswissenschaften eingesetzt. Das Anwendungsspektrum reicht hier von der systematischen Analyse von Protein-Medikament Interaktionen bis zur Kartierung des Proteoms von gesunden Geweben des Menschen. Beispielhaft sind im folgenden einige Arbeiten skizziert in denen das Gerät konkret eingesetzt wurde bzw. wird: 1. In Zusammenarbeit mit Forschern des Protein Atlas Projektes aus Schweden wurden die Proteome und Transkriptome von 29 verschiedenen Organen des Menschen untersucht. Aus diesen Daten konnte sowohl das Vorkommen als auch die relative Menge von gut 13.000 Proteinen im menschlichen Körper rekonstruiert werden. Die systematische Kombination mit Transkriptomdaten erlaubte ferner tiefgehende und neue Einsichten in die Mechanismen der Regulation der Proteinexpression welches für das komplexe Zusammenspiel biologischer Systeme von fundamentaler Bedeutung ist. 2. In ähnlicher Weise wurden mehr als 30 Gewebe von Organen der Maus untersucht, um eine Proteinexpressionskarte sowie Phosphorylierungskarte dieses wichtigen biomedizinischen Modellsystems zu erhalten. Auch helfen die parallel erhobenen Transkriptome beim Verständnis der Regulation der Proteinexpression und erlauben, die gefundenen Mechanismen zwischen Maus und Mensch zu vergleichen. 3. Eine weitere Hauptanwendung des geförderten Gerätes lag und liegt in der Erforschung der Wirkweisen von Medikamenten. Dazu entwickeln wir chemische Sonden, mit deren Hilfe wir die Selektivität von Krebesmedikamenten systematisch bestimmen können. Dies ist für die Entwicklung und den Einsatz derartiger Wirkstoffe wichtig, da der genaue Wirkmechanismus der Substanzen in Zellen oftmals nicht gut oder vollständig verstanden ist. Letzteres kann einerseits zur Erklärung von unerwünschten Nebenwirkungen dienen, als auch neue potentielle Anwendungsgebiete erschließen. 4. Verwand mit den unter 3. genannte Forschungsvorhaben ist die Untersuchung von Resistenzmechanismen gegenüber von Krebsmedikamenten. Dies stellt klinisch ein großes Problem dar. Mithilfe unserer Arbeiten z. B. zur Resistenz gegenüber Inhibitoren des EGF-Rezeptors (eine wichtige Zielstruktur bei Brust-Lungen- und Darmkrebs) konnten wir Veränderungen im Proteom und Phosphoproteom entdecken, die sowohl die Resistenzmechanismen erklären, als auch neue Ansätze zu ihrer Überwindung aufzeigen. 5. Das Gerät wird auch intensiv für die Entwicklung proteomischer Technologien genutzt. So konnten wir eine neue Art der Chromatographie für den Einsatz in der Proteomforschung evaluieren und konnten zeigen, dass diese einige Vorteile gegenüber herkömmlichen Verfahren bietet. Ferner arbeiten wir an der Optimierung bestehender Verfahren, um beispielsweise die Analyse von komplexen Proben zu beschleunigen, empfindlicher zu machen oder zu vertiefen. Ein weiterer wichtiger Aspekt stellt die Fortentwicklung der Bioinformatik für die Proteomforschung dar, da die erzeugten Datenmengen exponentiell wachsen und daher automatisierte Auswertungsverfahren benötigen. Das geförderte Gerät wird auch hier zur Erzeugung von Testdaten eingesetzt die ihrerseits zur weiteren Entwicklung der von der TUM entwickelten Datenplattform ProteomicsDB dienen (https://www.proteomicsdb.org).

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