SNP-dependent splicing as an evolutionary mechanism to increase proteome variability
Final Report Abstract
Die weitreichende evolutionäre und physiologische Bedeutung des differentiellen mRNA-Spleißens ist allgemein bekannt, besonders im Hinblick auf pathophysiologische und biomedizinische Fragestellungen. Man geht davon aus, dass bis zu 60 Prozent aller krankheitsverursachenden Mutationen auf eine Zerstörung von Spleißstellen zurückzuführen sind. Eine fehlerhafte Nutzung von vorhandenen Spleißstellen ist bereits für eine Vielzahl von Krankheiten bekannt. Die Identifizierung und funktionelle Annotation spleißrelevanter SNPs stellt eine große Herausforderung dar und bedarf der Unterstützung durch eine effiziente Methodik. 1) Zur Erleichterung des Screenings nach allelabhängigen Spleißereignissen wurde eine neue Hochdurchsatzmethodik entwickelt. Diese umfasst vier neue Software-Anwendungen und basiert hauptsächlich auf der Nutzung eines Panels von 92 übereinstimmenden Paaren individuenspezifischer gDNA- und cDNA-Proben. Für jeden der zu untersuchenden SNPs wurden 16 cDNAs mittels RT-PCR und anschließender Sequenzierung untersucht. Allelabhängige Spleißereignisse wurden durch Klonierung und Sequenzierung verifiziert. 2) In einem systematischen, SNP-zentrierten Ansatz wurden häufige SNPs an kanonischen Spleißstellen sowie an ESEs aus dbSNP gefiltert und mittels webbasierter Anwendungen als potentiell spleißrelevant klassifiziert. In einem zweiten Ansatz erfolgte die Klassifizierung der SNPs mittels eines neuronalen Netzwerkes. Die als spleißrelevant klassifizierten SNPs wurden im Anschluß mit der oben beschriebenen Methode untersucht. Zusätzlich wurde eine Gruppe von SNPs an NAGNAG Tandemakzeptoren getestet. Insgesamt wurden 223 nicht redundante Kandidaten-SNPs experimentell getestet. Dabei wurden 18 allelabhängige Spleißvorgänge identifiziert, von denen 15 neuartig waren und für 3 die funktionelle Relevanz bekannt ist. Dabei stellte sich die korrekte positive Vorhersagefähigkeit der bioinformatischen Tools als äußerst gering heraus - von 9% (für Spleißakzeptor-SNPs) für das neuronale Netzwerk bis zu 0% für den „ESEFinder". Zusammenfassend konnten die verwendeten bioinformatischen Anwendungen nur wenig zum Verständnis beitragen, wie häufige genetische Variationen das mRNA-Spleißen beeinflussen. Im Rahmen dieses Projektes wurde daraufhin ein Hochdurchsatz-in vitro-Spleißreportersystem entwickelt und im Hinblick auf die Fragestellung validiert. Das Reportersystem wurde genutzt, um spleißregulatorische Elemente und den Einfluß von SNPs auf deren Spleißeffizienz zu untersuchen. Die generierten Daten befinden sich gegenwärtig noch in der Auswertung.
Publications
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