Mechanismen der Entstehung von mitochondrialen DNA-Deletionen - Die Rolle der linearen mtDNA

• Antragsteller: Professor Dr. Wolfram S. Kunz; Dr. Gábor Zsurka
• Fachliche Zuordnung: Molekulare und zelluläre Neurologie und Neuropathologie ; Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 252501411

Deletionen der mitochondrialen DNA (mtDNA) sind oft die Ursache unzureichender mitochondrialer ATP-Synthese und gleichzeitig wichtige Indikatoren von mitochondrialen Schäden. Es wird vermutet, dass das Prozessieren der Enden linearer mtDNA-Moleküle (die durch oxidative Schäden oder eine Replikationsblockade entstehen können) eine wichtige Rolle bei der Bildung von mtDNA-Deletionen spielt. Einzelheiten der involvierten molekularen Prozesse sind allerdings nicht bekannt. Um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die das Prozessieren der linearen mtDNA mit der Generierung von Deletionen verbinden, haben wir Zellkulturmodelle ausgewählt, in welchem Doppelstrangbrüche der mtDNA durch in Mitochondrien induzierbar exprimierte Restriktionsendonukleasen entstehen. Da die Lokalisation und der Zeitpunkt des Doppelstrangbruchs in diesen Zellen streng kontrolliert sind, sind sie besonders gut geeignet, die ersten Schritte des Prozessierens von linearer mtDNA und der Generierung von Deletionen zu untersuchen. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass linearisierte mtDNA von den Enden aus zügig abgebaut wird, was auf die Wirkung einer Exonuclease-Aktivität hindeutet. Wir haben die Funktion der mitochondrialen Exonuclease MGME1 durch siRNA-Behandlung bzw. durch einen Knock-out mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems gehemmt und herausgefunden, dass das Fehlen von MGME1 die Degradation der linearen mtDNA maßgeblich verzögert. Unsere Hypothese ist, dass das andauernde Fortbestehen linearer mtDNA-Moleküle als Konsequenz eines nicht funktionierenden Abbaus direkte Auswirkungen auf die Generierung von Deletionen hat. In unserem beantragten Projekt haben wir vor, durch siRNA-Behandlung bzw. CRISPR/Cas9-induzierte Knock-outs mögliche weitere Komponenten der Degradationsmaschinerie zu hemmen und dadurch Proteine zu identifizieren, die beim Prozessieren von mtDNA-Enden, bei der mtDNA-Degradation und bei der Generierung von Deletionen mit MGME1 kooperieren. Hochdurchsatztechniken, wie die ultra-tiefe Sequenzierung des mitochondrialen Genoms, die wir bereits für den Nachweis von somatischen Veränderungen der mtDNA in humanen Gewebeproben etabliert haben, werden eine wichtige Rolle in der Charakterisierung der zeitabhängigen Vorgänge in unseren Zellkulturmodellen spielen. Ergebnisse aus diesen Modellen der Restriktionsendonuklease-generierten Doppelstrangbrüche sollen mit anderen mtDNA Schädigungsmodellen verglichen werden, in denen die mtDNA-Schäden durch oxidativen oder replikativen Stress hervorgerufen werden. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die einen Einfluss auf das Schicksal beschädigter DNA in Mitochondrien haben, ist unerlässlich, um Strategien zu entwickeln, die helfen können, dauerhafte Funktionsstörungen der Mitochondrien aufgrund der Akkumulation von mtDNA-Deletionen zu minimieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen