Transkriptomweite Analyse cytoplasmatischer mRNA Polyadenylierung und ihre Funktion in der axonalen Wegfindung: Wie RNA Prozessierungsschritte das Gehirn verkabeln

• Antragsteller: Dr. Bastian Linder
• Fachliche Zuordnung: Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 253180514

In unserem Gehirn müssen Dendriten und Axone von Milliarden von Nervenzellen exakt miteinander verknüpft werden. Um den Wachstumskegel an der Spitze sich entwickelnder Axone zu lenken, erfordern Signalmoleküle wie NGF und Sema3A die Translation von mRNAs die sich im Axon befinden. Wie diese lokale Translation reguliert wird, ist nicht vollständig bekannt, aber es wird angenommen, dass die mRNA-Polyadenylierung durch nicht-kanonische Poly(A)-Polymerasen eine essentielle Rolle spielt. Obwohl in Axonen eine Vielzahl von mRNAs zur Translation bereitsteht, wurde bisher nur für wenige eine intra-axonale Translation nachgewiesen. Dieses Missverhältnis stellt eine enorme Wissenslücke dar, die auf einem Mangel an Techniken zur Detektion axonaler Polyadenylierung und Translation beruht. Im Moment werden diese Ereignisse durch einen relativ langsamen Kandidatengen-Ansatz erforscht und nur ausgewählte Effektortranskripte bereits bekannter Signalwege getestet. Daher ist das komplette Repertoire an in Axonen translatierten mRNAs unbekannt.Hier schlage ich vor, diese mRNAs mittels eines neuartigen chemisch-genetischen Verfahrens zu identifizieren und ihre Rolle in der axonalen Wegfindung zu untersuchen. Der Ansatz basiert auf der Markierung polyadenylierter mRNAs mit 2-alkynyl-Adenosin, einem Adenosinderivat das im Labor von S. Jaffrey entwickelt und synthetisiert wurde. Dieses Molekül ist Substrat für nicht-kanonische Poly(A)-Polymerasen und kann kovalent an Biotin konjugiert werden. Daher kann es eingesetzt werden, um neu polyadenylierte mRNAs zu reinigen und zu identifizieren.Das erste Ziel ist, mit Hilfe von 2-alkynyl-Adenosin solche mRNAs zu identifizieren, die in Axonen durch NGF und Sema3A polyadenyliert werden. Dazu sollen sie aus NGF- und Sema3A-behandelten primären Neuronen gereinigt und mittels Hochdurchsatz- Sequenzierung identifiziert werden. In einem unabhängigen Ansatz soll ein kompartimentalisiertes Zellkultursystem zum Einsatz kommen, das eine direkte Reinigung dieser mRNAs aus Axonen ermöglicht.Das zweite Ziel ist es, die Rolle dieser mRNAs bei der axonalen Wegfindung zu analysieren. Dazu wird ihre intra-axonale Translation mittels immunfluoreszenzbasierter Proteinquantifizierung untersucht und anschließend mittels axonspezifischer RNA-Interferenz ihre Funktion im NGF-verursachten Axonwachstum sowie im Sema3A-verursachten Wachstumskegelkollaps analysiert.Diese Experimente werden neue Signalwege identifizieren, die der Funktion von NGF und Sema3A zugrunde liegen und neue Erkenntnisse über die Polyadenylierungsnetzwerke in der axonalen Wegfindung erlauben. Da die Polyadenylierung von mRNAs ein grundlegender Mechanismus der Genexpressionskontrolle ist, werden die hier etablierten Techniken auch bei der Aufklärung anderer Zellfunktionen helfen. Ebenso ermöglichen sie die Entdeckung neuer Mechanismen, die der fehlerhaften Translationsregulierung in neuropsychiatrischen Krankheiten zugrunde liegen.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor Samie R. Jaffrey, Ph.D.