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Influence of FMR1/FMRP expression on female folliculogenesis and ovarian reserve

Applicant Dr. Julia Rehnitz
Subject Area Reproductive Medicine, Urology
Term from 2014 to 2023
Project identifier Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 253279753
 
Final Report Year 2023

Final Report Abstract

Im Rahmen des Projektes wurde der Zusammenhang unterschiedlicher, nicht prämutierter GGG-Repeatlängen des FMR1-Gens auf beiden Allelen zur granulosazellulären Genexpression von Frauen mit unterschiedlichem Ansprechen auf eine ovarielle Stimulation untersucht. Es fanden sich speziell bei Frauen mit poor response und einem CGG-Repeat-Allel <26 im Vergleich zu allen anderen Gruppen von Frauen dabei ein signifikant erhöhtes FMR1-mRNA-Expressionslevel, das dadurch möglicherweise das ovarielle Ansprechen beeinflusst. Beim Krankheitsbild des Fragilen X Syndroms liegt eine komplette Promotormethylierung infolge der Expansion des Basentripletts vor. Wir haben hier im Rahmen des Projektes an humanen Granulosazellen ohne Prämutation die spezifische Promotormethylierung, auf beiden Allelen untersucht und konnten dabei drei variabel methylierte Regionen mit partieller Demethylierung identifizieren auf dem eigentlich inaktivierten, methylierten 2. Allel. Eine dieser Regionen (VMR3) wurde zudem als Zielbindungsstelle des methylierungsabhängigen Transkriptionsaktivator E2F1 identifiziert, der spezifisch von der Methylierung eines einzelnen CpGs abzuhängen scheint. Dieses CpG war auch in unseren Untersuchungen an Patientinnen abhängig vom ovariellen Ansprechen auf eine Stimulation unterschiedlich methyliert und die Expression von FMR1 zeitgleich signifikant unterschiedlich. Somit liegt nahe, dass die Bindung von E2F1 an diese Region in Granulosazellen die Effizienz der humanen Follikulogenese via epigenetische Mechanismen regulieren könnte. Ein vermuteter Mechanismus, der den negativen Feedback von weniger Protein bei steigender Genexpression bei PM-Trägern von FMR1 erklärt ist die so genannte RAN- („repeat associated non-AUG“) Translation. Sie ist von anderen Triplett Repeat Erkrankungen bekannt und führt infolge der Startcodon unabhängigen Translation, die die Basentripletts mit translatiert zu toxischen Proteinen. Bei FMR1 sind zwei solcher Proteine bekannt. Wir haben im Rahmen des Projektes humane Granulosa- und Blutzellen von Prämutationstragerinnen und unauffälligen Kontrollen auf das Vorliegen des Proteins FMRpolyG (eines der zwei bekannten RAN-translatierten Proteine von FMR1) hin gescreent und fanden erstmalig eine Akkumulation von FMRpolyG in peripheren Blutund Granulosazellen von FMR1-PM-Trägern in Form von Ubiquitin-positiven Einschlüssen. Interessanterweise waren bei Analyse der peripheren Blutzellen vor allem die T-Zellen von FMRPolyG Einschlüssen betroffen. Was dabei zudem eine immunologische Komponente, die gerade bei POI-Syndrom bekannt ist, untermauert. Bei Der Follikulogenese ist unter anderem der mTOR-AKT Signalweg in der frühen Follikelrekrutierung aktiv. Tiermodellstudien konnten zeigen, das FMRP, bei dem es sich um ein RNA bindenden Protein handelt, auch TSC2 und mTOR aus dem mTOR Signalweg binden kann. Im Rahmen beider Förderperioden führten wir zunächst in vitro Versuche an der Granulosazellkultur durch. Dabei konnte wurde gezeigt, dass ein möglicher funktioneller Zusammenhang zwischen der FMR1/FMRP-Expression und dem mTOR/AKT-Signalweg besteht. Unter FSH-Stimulation zeigte sich in der Zellkultur einen deutlichen Anstieg der AKT- und mTOR-Gen und Proteinexpressionen. FMR1 und S6K (als ein Endprodukt des Signalweges) waren hingegen signifikant reduziert exprimiert. Es zeigte sich zudem auf Proteinebene ein negativer Feedbackmechnismus von FMR1 und FMRP mit erhöhtem Protein bei erniedrigtem mRNA-Spiegel. Dieser Mechanismus konnte durch den mTOR Inhibitor Rapamycin entkoppelt werden. Unter Verwendung frischer GCs von Frauen mit unterschiedlicher Ovarialreserve fanden sich in folgenden Versuchen an ex vivo Patientinnenproben sich Hinweise auf eine signifikant positive Korrelation der FMR1-Expressionslevel mit den Expressionsspiegeln von AKT, TSC2, mTOR und S6K in humanen Granulosazellen von Frauen mit stärkerer Korrelation bei poor response. Außerdem wurde die Übertragbarkeit unserer Ergebnisse aus der Keimbahn auf Blutproben von Frauen mit POI/POF-Syndrom und Kontrollen untersucht. Hier konnten gezeigt werden, dass im peripheren Blut dieser Frauen ebenfalls eine Korrelation der FMR1-Expression mit den mTOR-, S6K- und TSC2- Expressionsspiegeln nachweisbar ist und dass bei POI/POF eine generelle Aktivierung des AKT/mTOR Signalweges vorliegt. Dies zeigt eine Übertragbarkeit dieses Schlüsselmechanismus in der Follikulogenese von der Keimbahn auf die Blutebene, persistierend über unterschiedliche Grade der Follikulogenesestörungen.

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