Multi-target silencing, genome editing and epitope mapping of tomato allergens
Final Report Abstract
Das vorgeschlagene Projekt zielte darauf ab, (I) die Machbarkeit einer simultanen Herunterregulierung mehrerer pflanzlicher Lebensmittelallergene zu testen, (II) neue Verfahren zur gezielten Veränderung pflanzlicher Genome zur Reduktion des allergenen Potentials der Tomate zu entwickeln und anzuwenden und (III) die allergenen Strukturen des Panallergens Profilin besser auf molekularer Ebene zu verstehen. Um das erste Ziel zu erreichen wurden chimäre RNAi Konstrukte in Tomaten transformiert, die bis zu drei unterschiedliche Allergene adressierten. In allen Fällen konnten Pflanzen generiert werden, die eine verminderte Expression der Allergene aufzeigten. Im zweiten Teil wurde zunächst versucht die Allergene Sola I 3.01 und Sola I 3.02 mittels TALE-Nukleasen auszuschalten. Überraschenderdweise zeigten allerdings die Tomatenpflanzen während der Transformation einen nekrotischen Zelltod, sodass keine Transformanden regeneriert werden konnten. Der Befund lässt vermuten, dass das bakterielle Protein vom pflanzlichen Immunsystem erkannt und eine Abwehrreaktion eingeleitet wird. Um dies zu umgehen wurde in einem zweiten Anlauf das CRISPR/Cas System verwendet. Hier konnten Tomatenpflanzen mit Mutationen in den Zielgenen regeneriert werden. Im letzten Teil wurden Peptidarrays, die unterschiedliche Profiline repräsentieren mit Antiseren unterschiedlicher Tomaten und Birkenallergiker inkubiert und das Muster der immun-reaktiven Peptide aufgezeichnet. Die Seren stammten von Patienten aus Nord- Mittel- und Südeuropa. In allen Fällen wurden Epitope nachgewiesen, die ganz oder auch teilweise überlappend mit der Aktinbindestelle des Proteins waren.
