Origin, phylogeny, evolution and structural basis of light-driven protochlorophyllide reduction
Final Report Abstract
Ein wichtiger Schritt im komplexen Biosyntheseweg von Chlorophyllen (Chls) und Bakteriochlorophyllen (BChls) ist die Reduktion der C17=C18 Doppelbindung des Protochlorophyllid (Pchlid) D-Rings, wodurch Chlorophyllid entsteht. Im Zuge der Evolution des Chl/BChl-Biosyntheseweges sind hierbei zwei strukturell unterschiedliche Enzymsysteme entstanden, die diese Reaktion katalysieren können, nämlich licht-unabhängige Pchlide-Oxidoreduktasen (DPORs) und lichtabhängige Pchlide- Oxidoreduktasen (LPORs). Lange Zeit wurde angenommen, dass anoxygene phototrophe Bakterien nur DPORs besitzen, während Cyanobakterien und höhere Pflanzen, mit Ausnahme von Gymnospermen, LPORs enthalten. Unsere Identifizierung einer funktionellen LPOR im aeroben anoxygenischen phototrophen α-Proteobakterium Dinoroseobacter shibae DFL12T stellte diese Vorstellung in Frage. Während der Reaktionsmechanismus von LPORs in den letzten Jahrzenten ausführlich untersucht wurde, ist aufgrund des Fehlens einer Röntgenstruktur wenig über die strukturelle Architektur von LPORs bekannt. Im beide Punkte zu adressieren, zielte die im Rahmen dieses Projekts durchgeführten Arbeiten darauf ab, die bisher nicht genutzte Sequenzvielfalt aus Datenbanken und Umweltproben (metagenomische Datensätzen und Banken) zu nutzen, um den evolutionären Ursprung, die Phylogenie sowie die strukturellen und funktionellen Grundlagen der lichtgesteuerten Funktion von LPORs zu klären. Basierend auf einer umfassenden Suche in über 100.000 bakteriellen Genomen konnten wir 37 neue putative LPORs in 35 Bakterien außerhalb von Pflanzen und Cyanobakterien (oxygene phototrophe Organismen) identifizieren, von denen die meisten in aeroben anoxygenen phototropen Bakterien (AAPB) zu finden sind. LPOR-Funktion konnte experimentell für 10 von 11 getesteten AAPB-LPORs nachgewiesen werden. Unsere Studie zeigt damit deutlich, dass funktionelle LPORs in AAPBs deutlich häufiger vorkommen, als zu Beginn des Projekts erwartet. Aus evolutionärer Sicht ist das wahrscheinlichste Szenario für das Vorhandensein von LPORs in AAPBs, horizontaler Gentransfer (HGT) von Cyanobakterien zu einem gemeinsamen Vorfahren der α/β-Proteobakterien. Unstimmigkeiten zwischen der Topologie des LPOR-Stammbaums und dem taxonomischen Stammbaum der Bakterien sprechen jedoch für eine komplexere Evolution, die auf mehrere HGTs innerhalb von AAPBs hindeutet. Aus funktionaler Sicht konnten für die untersuchten AAPB LPORs einige interessante Eigenschaften nachgewiesen werden, die sie von den getesteten pflanzlichen und cyanobakteriellen LPORs unterscheiden. Insbesondere wurden Unterschiede in den pH- und Temperatir Optimanbereichen und der Dissoziationskonstante (Kd) des ternären NADPH/Pchlide/LPOR-Komplexes beobachtet. Darüber hinaus zeigten AAPB LPORs im Vergleich zu den getesteten pflanzlichen/cyanobakteriellen LPORs eine Substratpräferenz für Monovinyl- oder Divinyl-Pchlid. Die Analyse zusätzlicher cyanobakterieller und pflanzlicher LPORs würde hier mehr Informationen über die Variation dieser biochemischen Eigenschaften zwischen verschiedenen Arten liefern und könnte so die Annahme bestätigen, dass die beobachtete Variation tatsächlich intrinsisch für AAPB LPORs ist. Auf struktureller Seite lieferten unsere Kleinwinkel-Röntgenstreuungsstudien einen ersten Einblick in die Struktur einer LPOR in Lösung, wobei nachgewiesen werden konnte, dass die Bildung des ternären NADPH/Pchlid/LPOR Komplexes zu einer Dimerisierung/Oligomerisierung des Proteins führt. Mittels quasi-elastischen inkohärenten Neutronenstreuungsexperimenten (QENS) und molekulardynamischen (MD) Simulationen konnten wir zeigen, dass die Bildung des ternären NADPH/Pchlid/LPOR-Komplexes sowie die Photoaktivierung zu einer Verringerung der Flexibilität des Proteins führen. Diese Studien erlaubten es uns, ein umfassendes Struktur/Funktionsmodell vorzuschlagen, das die aktuellen Erkenntnisse über die Bildung des ternären Komplexes, den Photoaktivierungsprozess, den Substratumsatz und die Produktfreisetzung wiederspiegelt. Auf der Anwendungsseite konnten wir zeigen, dass phototrophe Bakterien der Gattung Rhodobacter als indirekte Marker für die Anwesenheit und Aktivität von Makrophagen in soliden Tumoren eingesetzt werden können. Rhodobacter-Zellen produzieren große Mengen des photosynthetischen Pigments BChl a, das den spezifischen Nachweis dieser Bakterien in einem Tumor mittels multispektraler optoakustischer Tomographie (MSOT) ermöglicht. In weiterführenden Arbeiten könnte der Einsatz dieser Bakterien neue nicht-invasive Technologien ermöglichen und damit völlig neue Möglichkeiten für innovative Diagnose- und Therapieverfahren eröffnen.
Publications
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