Biogenese ribosomaler RNAs in Dictyostelium discoideum

• Antragsteller: Professor Dr. Christian Hammann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 259262141

Ribosomale RNAs (rRNAs) werden in Amöbe Dictyostelium discoideum in ungefähr 100 Kopien eines extrachromosomalen Palindroms kodiert, von denen vermutet wird, dass sie von einem einzelnen chromosomalen Locus abstammen. Um dies molekular zu untersuchen, werden wir eine genetisch markierte Version diese Locus generieren und analysieren, ob der Marker später auch in den extrachromosomalen Elementen gefunden werden kann. Wir werden bestimmen, ob sich die rDNA Kopienzahl während der Entwicklung ändert und ob neue rDNA Palindrome nach dem Schlüpfen der Sporen synthetisiert werden, oder zu einem anderen Zeitpunkt während der Entwicklung. Weiterhin werden wir untersuchen, ob alle 100 extrachromosomalen Elemente aktiv transkribiert werden, oder nur ein Teil. Eine wahrscheinlicher Weg des transkriptionellen Silencing ist DNA Methylierung. Dies wird indirekt durch unsere Beobachtung einer großen Menge an endogenen 21mer RNA Moleküle mit Sequenzidentität zur transkribierten Region des rDNA Palindrome in einer deep sequencing Untersuchung unterstützt. Um zu bestimmen, ob (RNA-vermittelte) DNA Methylierung aktiv ist, werden wir DNA aus verschiedenen genetischen Hintergründen mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen und Bisulfit-Sequenzierung untersuchen, um das DNA Methylierungsmuster auf den extrachromosomalen Elementen zu bestimmen. In den Sporen der Amöbe werden Vorläufer der reifen rRNAs eingelagert. Nachdem wir zuvor die Sequenzen der reifen rRNAs und ihrer Vorläufer bestimmt hatten, möchten wir hier molekular analysieren, was die Prozessierung der rRNAs in der Entwicklung anhält und an welchem Punkt. Wir werden die Sequenzen der eingelagerten Vorläufermoleküle und ihre sub-zelluläre Lokalisation bestimmen. Dazu haben wir ein Protokoll für RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) in D. discoideum entwickelt, das komplementär zu den vielen bereits im Labor etablierten Techniken (cRT-PCR, Northern Blot, primer extension, RT-PCR etc.) genutzt werden soll. Überraschenderweise konnten wir beobachten, dass das Dicer-Protein DrnB an der Reifung der rRNAs beteiligt ist, was in diesem Projekt genauer untersucht werden soll. Mittels Bioinformatik sollen weitere Enzyme identifiziert werden, die an der rRNA Reifung beteiligt sind. Zu ihrer Untersuchung sollen über eine kürzlich im Labor etablierte Einschrittklonierungstechnik Gendeletionsstämme hergestellt werden. Sollten die Stämme nicht lebensfähig sein, werden wir einen Knock-down mittels RNAi anwenden, um so den Funktion des betreffenden Enzyms in der RNA Reifung zu bestimmen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen