Untersuchung der IRF9-abhängigen IFNbeta Induktion durch virale dsRNAs

• Antragstellerin: Dr. Katharina Schulz
• Fachliche Zuordnung: Virologie ; Immunologie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 263073072

Doppelsträngige (ds) RNAs, die bei der Replikation der meisten Viren gebildet werden, werden von dem angeborenen Immunsystem erkannt. Die zellulären Rezeptoren, die die dsRNA registrieren, aktivieren den Transkriptionsfaktor Interferon (IFN) regulatory factor 3 (IRF3), der daraufhin die Typ-I IFN Produktion und die antivirale Immunantwort induziert. Allerdings besitzen die meisten Viren Möglichkeiten IRF3 zu inaktivieren, womit sich die Frage stellt, wie die antivirale Immunantwort stattdessen induziert wird. Interessanterweise können lange dsRNAs (größer oder gleich 1000 bp), anders als kurze (kleiner oder gleich 500 bp), die Typ-I IFN Produktion auch in Abwesenheit von IRF3 induzieren. Dieser Effekt wurde jedoch in Abwesenheit von IRF9 nicht beobachtet (DeWitte-Orr et al.; J. Immunol. 183, 2009), was darauf hindeutet, dass IRF9 IRF3 ersetzen kann. Das Ziel meines Projektes ist, die Signalkaskade, die von langen dsRNAs in Abwesenheit von IRF3 induziert wird, zu untersuchen. Hauptziel dabei ist zu klären (i) wie IRF9 durch lange dsRNAs aktiviert wird, (ii) wie die Transkription von IFNbeta durch IRF9 induziert wird und (iii) warum dieser Signalweg nur von langen dsRNAs eingeleitet wird. Zur Aufklärung der IRF9 Aktivierung werden zunächst post-translationale Modifikationen von IRF9 mittels 2D-Gelelektrophorese, beziehungsweise Immunpräzipitation und Massenspektrometrie, analysiert und die beteiligten Protein-Kinasen mit Hilfe von siRNA-Studien untersucht. Da vermutet wird, dass IRF9 Homo- oder Heterodimere bildet, soll dies über konfokale Immunfluoreszenz und native Gelelektrophorese untersucht werden. Nachfolgend werden detaillierte Analysen mittels Immunpräzipitation und anschließender Massenspektrometrie durchgeführt. Die Induktion der IFNbeta-Transkription wird mit Hilfe von DNA-Pulldown Assays und Chromatin-Immunpräzipitationen (ChiP) untersucht. Anschließend sollen verschiedene Schritte der Kaskade blockiert und die Funktionalität durch Messungen der IFNbeta-Produktion mittels quantitativer Real-time PCR (qRT-PCR) überprüft werden. Zusätzlich werden die Überstände der stimulierten Zellen auf Wildtyp-Zellen überführt und funktionelles IFNbeta mit Hilfe von standardisierten antiviralen Methoden nachgewiesen. Die Experimente werden nach Stimulation mit langen und kurzen dsRNAs durchgeführt um herauszufinden, warum kurze dsRNAs diesen Signalweg nicht aktivieren können. Die Ergebnisse dieser Analysen sollten wichtige Hinweise liefern, wie das angeborene Immunsystem auf virale Infektionen reagiert und diese kontrolliert, sowie mögliche Angriffspunkte für neue, bessere antivirale Therapien aufzeigen.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Kanada
• Gastgeberin: Professorin Dr. Karen Mossman