Interacting partners of the neuronal glycine transporter GlyT2: identification, validation and characterization
Final Report Abstract
Schnelle inhibitorische synaptische Übertragung im Zentralnervensystem von Säugetieren erfolgt durch den Neurotransmitter Glycin. Dieser Botenstoff wird durch sekundär-aktive Wiederaufnahme rasch aus dem synaptischen Spalt entfernt und recycelt. Die Wiederaufnahme dient auch der neuronalen Glycin-Homöostase. An der Wiederaufnahme in präsynaptische glycinerge Neurone ist das Protein GlyT2 beteiligt, der Glycin-Transporter 2. Wie die meisten Proteine agiert GlyT2 nicht isoliert und allein, sondern innerhalb eines makromolekularen Proteinkomplexes und in unmittelbarer Kooperation mit mehreren Interaktionspartnern. Ziel dieses Projektes war es, solche Interaktoren in Screening-Analysen zu identifizieren und anschließend zu validieren. Dabei sollten neue Kandidaten, aber auch bereits beschriebene entdeckt werden (14 solcher Proteine waren bereits beschrieben und dienten dem Proof of Concept bzw. der Bekräftigung). Analysematerial war Gehirngewebe von juvenilen Mäusen. Glyt2-Knockout-Mäuse wurden zur Kontrolle verwendet, um falschpositive Funde rauszufiltern. Mittels Co-Immunpräzipationen, dem Gold Standard für Protein-Protein-Interaktionen, und hochsensitiver shot-gun Massenspektrometrie identifizierten wir - selbst unter stringenten Filterkriterien - 65 putative Interaktoren. Von diesen waren 59 Neuentdeckungen, weitere sechs wurden bestätigt. Damit konnten wir die Zahl der putativen Interaktoren auf mehr als das 5-fache erweitern (auf 75). Ungefähr die Hälfte der putativen Interaktoren spielen eine Rolle in ‚protein trafficking‘ und ‚location‘. GlyT2 wird in der Fachliteratur zunehmend in Zusammenhang mit neuropathischen, inflammatorischen Schmerzmodellen gebracht. Eine erhöhte glycinerge Transmission an Schmerzneuronen reduziert Schmerz. GlyT2 Modulatoren und Inhibitoren könnten dadurch bei der Bekämpfung von chronischem Schmerz an Bedeutung gewinnen. Unsere Liste der 59 Neuentdeckungen könnte die Suche nach geeigneten Substanzen zur pharmakologischen Intervention erleichtern und konkretisieren. Die große Anzahl der neuentdeckten putativen Interaktionspartner von GlyT2 war eine positive Überraschung. Ein Kandidatenprotein, CAPS1, wurde in mehreren Folgeanalysen auf physikalische und funktionelle Interaktion mit GlyT2 getestet. Die meisten dieser Analysen wurden an nicht-neuronalen Assays und mittels ‚Live-cell imaging‘ durchgeführt. Sie erbrachten positive Evidenz und veranlassten uns zur folgenden Hypothese: die GlyT2/CAPS1-Interaktion resultiert (aktivitätsabhängig) in einer reduzierten Oberflächenexpression von GlyT2. Überraschenderweise ergaben sich dann in einem neuronalen Assay (Spinalneuronkulturen), vermutlich molekular-technisch bedingt, keine aussagekräftigen Ergebnisse in dieser Richtung, so dass die zuvor formulierte Hypothese zurzeit nicht mehr aufrechterhalten werden kann.
