Die Rolle von DNA-Methylierungen in Cyanobakterien - von der Regulation der Genexpression zu DNA Reparaturprozessen und zurück

• Antragsteller: Professor Dr. Martin Hagemann; Professor Dr. Wolfgang R. Hess
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 269028174

Die Funktion von DNA-Methylierungen, insbesondere von 5-Methylcytosin (5mC) als ein entscheidendes Element in der epigenetischen Genregulation ist bei vielen Eukaryoten gut verstanden. In Prokaryoten existieren vielfältigere Typen an DNA-Methylierungen, die mit sehr verschiedenen Funktionen assoziiert sein können. In Bakterien spielen DNA-Methylierungen eine Rolle beim Schutz der eigenen DNA vor Restriktionsenzymen, bei der Replikationsinitiation sowie der DNA-Reparatur. Einige Arbeiten haben auch bei Bakterien einen Einfluss der DNA-Methylierung auf die Regulation der Expression ausgewählter Gene nachgewiesen. Diese Funktionen und die involvierten Mechanismen sind jedoch nur wenig verstanden. In der ersten Förderperiode haben wir eine systematische Untersuchung von DNA-Methylierungen in dem Modellcyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 vorgenommen. Wir haben fünf DNA-Methyltransferasen identifiziert und in unterschiedlichem Umfang charakterisiert. Die Spezifität aller fünf Enzyme (M.Ssp6803I-V) wurde Genom-weit experimentell analysiert und in genetischen sowie biochemischen Experimenten für vier der fünf Enzyme exakt charakterisiert. Drei für Methyltransferasen kodierende Gene konnten mutiert werden, wohingegen sich die Gene für M.Ssp6803III und M.Ssp6803IV nicht deletieren ließen, was auf deren essentielle Funktion hindeutet. Die Deletionsmutante für M.Ssp6803II wies einen deutlich ausgeprägten Phänotyp auf, der durch Re-Insertion des entsprechenden Gens sll0729 komplementiert werden konnte. Das häufige Auftreten spontaner Suppressormutanten zeigte, dass der Verlust der von M.Ssp6803II vermittelten 4mC Modifikation einen starken Selektionsdruck ausübt. Der Vergleich solcher Suppressormutanten mit dem Wildtyp und der Deletionsmutante lieferte klare Hinweise, dass diese DNA-Methylierung an der DNA-Reparatur und –Replikation beteiligt ist und identifizierte zwei Gene mit reproduzierbar veränderter Expression, von denen eines eine Methyltransferase unbekannter Funktion kodiert. Bisulfitanalysen zeigten, dass bestimmte Bereiche des Synechocystis-Genoms hypomethyliert vorliegen und evtl. weitere Methylierungsaktivitäten existieren. Im Rahmen des Fortsetzungsantrages wollen wir diesen Hinweisen nachgehen, und Mechanismen für die Variation im Methylierungsgrad sowie daran beteiligte Faktoren identifizieren. Dazu werden wir eine 5mC/4mC-doppelt-defiziente Methylierungsmutante herstellen und analysieren, die Methylierungsmuster im Wildtyp unter verschiedenen Bedingungen zu analysieren und einen von uns entdeckten Effekt auf die Dynamik der Genexpressionsregulation genauer zu untersuchen. Weiterhin planen wir die isolierten Suppressormutanten zu sequenzieren sowie die Rolle der bisher nicht untersuchten essentiellen Methylasen in Stämmen mit ihrer konditionalen Expression zu analysieren. Diese Untersuchungen sollen aufzeigen, wie DNA-Methylierungen mit ihren multiplen Funktionen in das globale Regulationsnetzwerk bei Cyanobakterien eingebunden sind.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen