Die Rolle von DNA-Methylierungen in Cyanobakterien - von der Regulation der Genexpression zu DNA Reparaturprozessen und zurück
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Unser Projekt zielte auf die Existenz und die Bedeutung möglicher epigenetischer Kontrollmechanismen in Bakterien, hier in einem Cyanobakterium. Zu Beginn des Projekts waren die zugrundeliegende Genetik, Biochemie und mögliche Mechanismen einer solchen epigenetischen Kontrolle noch völlig unbekannt. Die systematische Untersuchung vor DNA-Methylierungen in dem Modell-Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 ergab, dass fünf DNA-Methyltransferasen (M.Ssp6803I-V) in diesem Organismus aktiv sind. Die Spezifität aller fünf Enzyme wurde genomweit experimentell analysiert und für vier der fünf Enzyme in genetischen und biochemischen Experimenten genauer charakterisiert. Drei der für die Methyltransferase kodierenden Gene konnten mutiert werden, während die Gene für M.Ssp6803III und M.Ssp6803IV nicht deletiert werden konnten, was auf ihre essentielle Funktion hinweist. Die Deletionsmutante für M.Ssp6803II wies einen ausgeprägten Pigmentierungs- und Wachstums-bezogenen Phänotyp auf, der durch die Re-Insertion des entsprechenden Gens sll0729 komplementiert werden konnte. Das häufige Auftreten spontaner Suppressor-Mutanten zeigte, dass der Verlust der durch M.Ssp6803II vermittelten 4mC-Modifikation einen starken Selektionsdruck ausübt. Der Vergleich solcher Suppressor-Mutanten mit dem Wildtyp und der Deletionsmutante lieferte klare Hinweise darauf, dass diese DNA-Methylierung an der DNA-Reparatur und Replikation beteiligt ist. Wir haben sieben isolierte Suppressor-Mutanten resequenziert und eine GGCC-zu-GGTC-Punktmutation in der Diskriminatorregion des slr1790 Promotors als einzige gemeinsame Mutation identifiziert. Dieses Gen kodiert die Protoporphyrinogen IX-Oxidase, HemJ. Transkriptom- und qPCR-Analysen zeigten eine abweichende Expression von slr1790 in der ∆sll0729-Mutante. Wir konnten nachweisen, dass diese Abweichung zu einer Akkumulation von Coproporphyrin III und Protoporphyrin IX führte, konsistent mit einer gestörten HemJ-Aktivität. Um die Bedeutung der DNA-Methylierung zu verifizieren, wurden hemJ-Promoter-Varianten mit unterschiedlichen Diskriminatorsequenzen in den Wildtyp eingeführt, gefolgt von einer sll0729-Deletion. Die sll0729-Deletion segregierte in Stämmen mit dem GGTC-Diskriminator-Motiv, was zu einer Wildtyp-ähnlichen Pigmentierung führte, während frisch hergestellte ∆sll0729-Mutanten mit dem nativen hemJ-Promotor den Mutanten-Phänotyp aufwiesen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass N4-Methylcytosin relevant für die korrekte hemJ-Expression ist. Somit konnte die 4mC-Modifikation als wichtiger epigenetischer Marker in Synechocystis und wahrscheinlich auch in anderen Bakterien etabliert werden. Bisulfit- und SMRT-Sequenzierungsanalysen zeigten, dass es im Synechocystis-Genom weitere Erkennungsmotive gibt, die hypo- und hemimethyliert sind. Einige Motive befinden sich innerhalb ähnlicher kritischer Promotoreinstellungen wie für das hemJ-Gen und korrelieren mit abweichenden Transkriptionsniveaus in Methylierungs-negativen Mutantenstämmen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Identification of the DNA methyltransferases establishing the methylome of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. DNA Research, 25(4), 343-352.
Hagemann, Martin; Gärtner, Katrin; Scharnagl, Matthias; Bolay, Paul; Lott, Steffen C.; Fuss, Janina; Huettel, Bruno; Reinhardt, Richard; Klähn, Stephan & Hess, Wolfgang R.
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Cytosine N4-Methylation via M.Ssp6803II Is Involved in the Regulation of Transcription, Fine- Tuning of DNA Replication and DNA Repair in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Frontiers in Microbiology, 10.
Gärtner, Katrin; Klähn, Stephan; Watanabe, Satoru; Mikkat, Stefan; Scholz, Ingeborg; Hess, Wolfgang R. & Hagemann, Martin
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Divergent methylation of CRISPR repeats and cas genes in a subtype I-D CRISPR-Cas-system. BMC Microbiology, 19(1).
Scholz, Ingeborg; Lott, Steffen C.; Behler, Juliane; Gärtner, Katrin; Hagemann, Martin & Hess, Wolfgang R.
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Epigenetic control of tetrapyrrole biosynthesis by m4C DNA methylation in a cyanobacterium. DNA Research, 31(6).
Schmidt, Nils; Stappert, Nils; Nimura-Matsune, Kaori; Watanabe, Satoru; Sobotka, Roman; Hagemann, Martin & Hess, Wolfgang R.
