Regulation und Funktion der Internalisierung und des intrazellulären Transports von TNF-Rezeptor 1 (TNF-R1) in der Signaltransduktion und auf die biologischen Effekte von TNF

• Antragsteller: Professor Dr. Stefan Schütze
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 269124904

In dem vorgeschlagenen Projekt möchten wir die räumliche und zeitlichen Regulation und Funktion der kompartimentierten TNF-R1 Signaltransduktion untersuchen. In vorhergehenden Studien konnten wir zeigen, dass die TNF-vermittelte Internalisierung des Rezeptors ein früher Regulationsmechanismus der proliferativen und apoptotischen Signaltransduktion darstellt. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir gezeigt, dass die Endozytose des TNF-R1 sowie dessen intrazellulärer Transport von der K63-ubiquitinierung des Rezeptors abhängig sind. Nach Identifizierung der E3 Ubiquitin-Ligase RNF8 sowie deren anschließender Herunterregulation konnte eine komplette Blockade des apoptotischen Signalweges einhergehend mit einer erhöhten Proliferation nachgewiesen werden. In diesem Projekt möchten wir die molekularen Mechanismen der Internalisierung und des intrazellulären Transports des TNF-R1 im Detail aufklären. Dazu sollen folgende Fragestellungen bearbeitet werden:(I.) Regulation der TNF-R1-Ubiquitinierung: ist die Phosphorylierung und / oder palmitoylierung des TNF-R1 Voraussetzung für die Rekrutierung von RNF8? Welche weiteren, mit RNF8 interagierenden Proteine sind an der TNF-R1-Ubiquitinierung beteiligt? Welche Aminosäuren des TNF-R1 werden ubiquitiniert, phoshoryliert und/oder palmitoyliert? (II.) Charaktierisierung der mittels Proteom-Analyse identifizierten K63-Ubiquitin-bindenden Proteinen die an der Bildung und dem Transport von TNF-Rezeptosomen beteiligt sind. (III.) Untersuchung der molekularen Regulation der Fusion von Rezeptosomen mit trans-Golgi-Vesikeln sowie deren Integration in multivesikuläre Kompartimente. (IV.) Analyse TNF-induzierter Veränderungen der Proteinzusammensetzung in anderen subzellulärer Kompartimenten (z.B. Zytosol, Zellkern, Mitochondrien, Lysosomen) mittels differentieller Färbung der Proteine und 2D-differentieller Gelelektrophorese (2D-DIGE) gefolgt von massenspektrometrischer Analyse. (V.) Untersuchung von TNF-induzierten funktionellen Interaktionen von an der TNF-Signaltransduktion aus Rezeptopsomen beteiligten Proteinen mit Hilfe der zweidimensionalen blue-native Gelelektrophorese, Western-blot und Massenspektrometrie. (VI.) Die biologische Relevanz neu charakterisierter Komponenten der TNF-Signaltransduktion soll in Tumorzelllinien untersucht werden, die eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber TNF-induzierter Apoptose aufweisen. (VII.) In weiterer Perspektive sollen die Erkenntnisse der räumlichen und zeitlichen Regulation der TNF-R1-Signaltransduktion auf die anderen Mitglieder der TNF-Rezeptor Superfamilie, CD95 und TRAIL-R1/R2, angewendet werden.Von den geplanten Untersuchungen erwarten wir detaillierte Einblicke in die molekularen Mechanismen der Induktion von Proliferation und Apoptose durch Todesrezeptoren. Diese Erkenntnisse sollen es ermöglichen, zielgerichtet mit den rezeptorvermittelten Signalwegen in Tumoren und entzündeten Geweben zu interferieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen