Zellsortiergerät

• Subject Area: Microbiology, Virology and Immunology ; Medicine
• Term: Funded in 2015
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 269417992

• Final Report Year: 2019

Final Report Abstract

Das Gerät steht im zentralen Labor für Zellanalyse (Multi-User Facility) der Universität Stuttgart und wird von mehreren Instituten/Arbeitsgruppen verwendet. Nachfolgend beschrieben werden in Kurzform die wichtigsten Forschungsprojekte der letzten drei Jahre: 1. Ziel dieses Projekts war die Funktionsoptimierung des Prototypen EHD2-scTNFR2 durch „Genetic Engineering" und die Analyse der Wirkung von TNFR2-Agonisten auf verschiedene Zelltypen in vitro und in vivo, um ein tieferes Verständnis der zellulären Effekte des TNFR2 zu erlangen. Für die in vitro Analysen wurden Zellmodelle für die BlutHirn-Schranke und das zentrale Nervensystem untersucht. Hierzu standen entsprechende humanisierte Mausmodelle zur Verfügung. Dabei wurden Splenozyten aus der Maus isoliert und mit dem FACS nach verschiedenen Markern sortiert und isoliert. Die Ergebnisse dieses Forschungsvorhabens haben unser Verständnis über die Mechanismen der TNFR2-vermittelten Geweberegeneration und Immunmodulation erweitert. 2. Mit einer RNAi Bibliothek (6100 shRNA's, zielgerichtet auf 1100 chromatin-assoziierte Gene) transduzierte 3t3 Zellen wurden mittels FACS auf veränderte Aktvität eines epigenetschen Effektors sortert. Hierzu wurde ein mCherry Reporter System verwendet. 3. Hek293 Zellen wurden transient mit CRISPR/sCas9-basierten EpiEditors und sgRNA codierten Vektoren transfiziert und mittels FACS auf doppelt positve Zellen sortert. 4. Das FACS wurde verwendet um Tumortarget Einzel- und Doppletransfektanten zu sortieren, die für die Etablierung neuer Tumormausmodelle verwendet werden. 5. Es wurden mit dem FACS verschiedene Melanomzelllinien sortert (MeWo, WM3211 und WM115) um Caspase-8 knockout Klone zu selektonieren. 6. Im Rahmen einer Bachelor Arbeit wurden einerseits Spheroide dissoziiert und nach TRAILR1 Expression sortert, zum anderen wurden in einer Masterarbeit DR5 knockout Zellen selektoniert. 7. Im Rahmen des Projektes wurden mit CRISPR/Cas9 TAK1-defiziente WM1791 Melanomzellen generiert. GFP-positve Einzelklone wurden zwei Tage nach Transfekton per FACS selektoniert. Experimente mit diesen Zellen ergaben, dass TAK1 die Sensibilität der Melanomzellen für den programmierten Zelltod reduziert und im Patenten für die Progression der Krankheit verantwortlich sein kann. 8. Es wurde retroviral eine MCF10A Zielllinie generiert, welche via Doxycyclin-Indukton PKD3WT-EGFP exprimiert. Damit wurde der Zusammenhang zwischen PKD3 und Brustkrebsstammzellen untersucht. Um ausschließlich transduzierte Zellen untersuchen zu können, wurde über einen kurzen Zeitraum die PKD3WT-EGFP Expression induziert und die Zellen mit dem FACS Aria nach EGFP positven Zellen sortert. Diese Zellpopulaton wurde anschließend erfolgreich für Stammzelluntersuchungen verwendet. 9. Um die Effekte der miR-149 auf die Eigenschaften primärer Brusttumore inklusive der Interakton der Tumor-Mikroumgebung zu untersuchen wurden Brustkrebszellen benötgt, die die miR-149 stabil exprimieren. Hierzu wurden MDA-MB-231 Zellen transient mit miR-149 transfiziert und mit dem FACS sortert.

Publications

• (2019) TAK1 suppresses RIPK1-dependent cell death and is associated with disease progression in melanoma. Cell death and differentiation 26 (12) 2520–2534
  Podder, Biswajit; Guttà, Cristiano; Rožanc, Jan; Gerlach, Elke; Feoktistova, Maria; Panayotova-Dimitrova, Diana; Alexopoulos, Leonidas G.; Leverkus, Martin; Rehm, Markus
  
• Novel strategies to mimic transmembrane tumor necrosis factor-dependent activation of tumor necrosis factor receptor 2. Sci Rep. 2017 Jul 26;7(1):6607
  Fischer R, Marsal J, Gutta C, Eisler SA, Peters N, Bethea JR, Pfizenmaier K, Kontermann RE
  
• Chromatin-dependent allosteric regulation of DNMT3A actvity by MeCP2. Nucleic Acids Res. 2018 Sep 28;46(17):9044-9056
  Rajavelu A, Lungu C, Emperle M, Dukatz M, Brohm A, Broche J, Hanelt I, Parsa E, Schiffers S, Karnik R, Meissner A, Carell T, Rathert P, Jurkowska RZ, Jeltsch A
  
• Selective Activation of Tumor Necrosis Factor Receptor II Induces Antiinflammatory Responses and Alleviates Experimental Arthritis. Arthritis Rheumatol. 2018 May;70(5): 722-735
  Fischer R, Proske M, Duffey M, Stangl H, Martínez GF, Peters N, Kraske A, Straub RH, Bethea JR, Kontermann RE, Pfizenmaier K
  
• Stable Expression of Epigenome Editors via Viral Delivery and Genomic Integration. Methods Mol Biol. 2018;1767:215-225
  Kroll C, Rathert P